4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh học của
Trichoderma thu ở 3 vùng miền khác nhau
Phương pháp nghiên cứu phân lập, định loại, mô tả hình thái dựa theo các tài liệu chuyên khảo nghiên cứu về vi sinh vật và nấm Trichoderma được công
bố trên thế giới của các tác giả như Christan P.Kubicek and Gary E. Harman (2002), Nguyễn Lân Dũng (2006), B B Joshi, R P Bhatt, D Bahukhandi, (2010), Samuels G.J. et al (2010).
Chuẩn bị môi trường PDA
- Môi trường PDA.
- Một số môi trường nuôi cấy sử dụng trong định loại nấm Trichoderma + Papavizas and Lumsden (1982):
Nước trái cây 200 ml, nước 800 ml; agar 20 g/l, glucose 1 g/l; kháng sinh 100 µg/l (neomycin sulfate, bacitracin, penicillin) và chloroneb 100 g/l; chlortetracycline hydrochloride 25 g/l, nystatin 20 g/l, propionate 500 g/l; alkylaryl polyether alcohol is added to suppress Mucorales at 2.0 ml/l.
+ TSMC (Elad and Chet, 1983):
MgSO4.7H2O 0.2 g/l; K2HPO4 0.9 g/l; KCl 0.15 g/l; NH4NO3 1.0 g/l; glucose 3.0 g/l, chloramphenicol 0.25 g/l, fenaminosulf 0.3 g/l, pentachloronitrobenzene 0.2 g/l, rose bengal 0.15 g/l, captan 0.02 g/l (post autoclaving), agar 20 g/l.
+ Modified TSM (Smith et al., 1990):
Ca(NO 3)2 1.0 g/l, KNO3 0.26 g/l, MgSO4.7H2O 0.26 g/l, KH2PO4 0.12 g/l, CaCl2.2H2O 1.0 g/l, citric acid 0.05 g/l, sucrose 2.0 g/l, agar 20.0 g/l, Igepal 630 (Alltech Associates, Inc., Deerfield, IL) 1.0 ml, chlortetracycline 0.05, captan (50% wettable powder) 0.04, vinclozolin 0.0025 g/l.
Nuôi cấy nấm trên môi trường PDA
- Cấy chuyền và nuôi cấy nấm trên PDA trong đĩa Petri
Bước 1. Chuẩn bị môi trường (PDA có thêm chất kháng sinh), các dụng cụ để phân lập và nuôi cấy.
Bước 2. Rây đất và pha loãng dung dịch đất trong nước 2 -3 lần Bước 3. Dùng que lốp quyét đều dung dịch đất lên môi trường PDA Bước 4 Sau 2- 3 ngày quan sát thấy khuẩn lạc trên đĩa dùng dụng cụ phân
lập cấy chuyền làm thuần sang đĩa môi trường PDA sạch.
Bước 5. Sau phân lập bảo quản trong tủ nuôi cấy 20-250C hoặc trong hộp nhựa có giấy ẩm, quan sát sự phát triển khuẩn lạc nấm
Mô tả, phân loại và so sánh hình thái
(1) Giai đoạn 1: Làm slide
Tiến hành làm slide để quan sát cấu trúc perithecia, asci, ascus, đầu ascus, ascospore và part-spore của dạng sinh sản hữu tính và quan sát cấu trúc sinh bào tử, tế bào mẹ sinh thành bào tử (conidiogenous cell), metulae, vesticle và bào tử đối với các dạng sinh sản vô tính.
Cách làm slide cụ thể như sau:
Bước 1: Lựa chọn đĩa khuẩn lạc sau cấy thuần khoảng 3 ngày.
Bước 2: - Dùng panh hoặc que cấy tiến hành lấy một mẩu khuẩn lạc phía ngoài rìa mép.
Rửa qua cồn 75% hoặc nước cất để loại bỏ bớt bào tử trước khi chuyển vào giọt nước hoặc Lactic acid blue cotton.
Bước 3: Dùng que cấy để làm cho sợi nấm, cấu trúc sinh bào tử và bào tử phân bố rải rác trên slide giúp cho slide dễ quan sát hơn.
Bước 4: Dùng cover đã hơ qua ngọn lửa đèn cồn để đậy lên. Bước này tiến hành làm chậm để hạn chế tối đa các bọt nước ở trong slide.
Bước 5: Dùng đầu tẩy bút chì để ép nhẹ cover trên slide.
Bước 6. Dùng giấy thấm để loại bỏ nước dư có trong slide trước khi quét sơn. Bước 7. Dùng sơn móng tay trong để quét 4 phía của cover. Bước 8. Bảo quản trong hộp slide.
(2) Giai đoạn 2: Tiến hành quan sát, đo đếm, mô tả kích thước, hình dạng màu sắc của các cấu trúc vi học như cụm/mụn (Pustule), cuống bào tử đính (conidiophores), thể bình (Phialides), bào tử vô tính (conidia), bào tử hậu (Chlamydospores),...
(3) Giai đoạn 3: Dựa trên những số liệu thu thập được từ mẫu vật, đặc điểm sinh trưởng và phát triển trên môi trường nuôi cấy (PDA) và căn cứ vào các khoá định loại đến giống, loài để tiến hành định danh cho từng loài nấm cụ thể, và so sánh đặc điểm hình thái của các chủng nấm thu thập ở 3 miền Bắc, Trung, Nam.
Phương pháp nuôi cấy các chủng nấm thu thập được từ 3 vùng miền Bắc, Trung, Nam trên môi trường PDA ở các ngưỡng nhiệt độ khác nhau (Từ 25-300C, dưới
250C, trên 300C); ở các ngưỡng pH khác nhau (6-7, 4-5, 7-8) để so sánh đặc điểm sinh học của 8 chủng nấm thu được.
* Chỉ tiêu theo dõi: Tốc độ sinh trưởng của các chủng nấm và khả năng sinh bào tử.