NGUYấN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2.2.10. Xỏc định thành phần cỏc loại đường, cyclodextrin bằng phương phỏp sắc ký giấy
phỏp sắc ký giấy
* Dung cụ và húa chất:
- Giấy sắc ký Whatman No 1-2 (Anh) hoặc giấy FN 1-2 (Đức) - Hỗn hợp dung mụi: Butanol : Pyridine : H2O = 6 : 4 : 3 (v/v)
- Micropipet, chậu thủy tinh đựng dung mụi, giỏ chấm sắc ký, tủ sấy, cồn tuyệt đối.
- Thuốc hiện màu: 1g analine hydroclorit / 100ml axeton. Dựng bơm phun thuốc hiện màu lờn giấy sắc ký sau khi chạy xong
- Chất chuẩn: cỏc loại đường và CD
* Tiến hành:
Dựng thước và bút chỡ kẻ vạch một đường ngang trờn mặt phải của giấy, cỏch mộp dưới của giấy 3 cm. Trờn đường kẻ này chấm những chấm bằng bút chỡ để nhỏ mẫu, mỗi chấm cỏch nhau 3 cm.
Dựng micropipet nhỏ chớnh xỏc 0,01 ml dung dịch mẫu chuẩn tương ứng 0,01g chất chuẩn vào chỗ chấm trờn giấy (tiến hành ít nhất 2 chấm).
Dựng micropipet nhỏ chớnh xỏc 0,01 ml dung dịch mẫu cần phõn tớch vào chỗ chấm trờn giấy (tiến hành ít nhất 2 chấm) và để khụ (cú thể dựng búng đốn sấy)
Chạy sắc ký: Cuộn giấy sắc ký đó chấm mẫu cho vào bỡnh đựng dung mụi sao cho mặt dung mụi cỏch điểm chấm mẫu khoảng 0,5 cm. Đậy kớn nắp bỡnh dung mụi. Để dung mụi chạy cho đến khi cỏch mặt giấy khoảng 2-3 cm thỡ lấy ra và để khụ ở nhiệt độ phũng (cú thể sấy nhẹ 40-600C)
Phun dung dịch hiện màu tỏa đều khắp mặt giấy (phun thành tia, trỏnh phun thành giọt), để yờn trong 5 phút. Đưa giấy vào tủ sấy đang ở nhiệt độ 1050C, sấy trong 10 phút để hiện màu.
Dựng bút chỡ khoanh những vết cú màu chạy ngang với mẫu chuẩn. Cắt cỏc vết màu đú sao cho diện tớch bằng nhau, cắt một mẫu trắng. Mỗi miếng giấy cho vào 1 ống nghiệm. Cho vào mỗi ống nghiệm chớnh xỏc 3 ml dung dịch cồn (cồn 960 : nước = 1:1 theo thể tớch). Đậy nút kớn, ngõm cỏc vết màu khoảng 1 -2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ ống nghiệm, để cỏc ống nghiệm trong tối. Sau khi giấy thụi hết màu, đem đo dịch trờn mỏy so màu (OD) ở bước súng 580nm
* Tớnh toỏn kết quả:
Từ mật độ quang và nồng độ dung dịch mẫu chuẩn, ta tớnh ra đượng hàm lượng chất đú trong mẫu phõn tớch
Trước hết ta tớnh hàm lượng chất cần phõn tớch cú trong 0,01 ml dung dịch mẫu:
0,01 x (ODm - ODt) M (g) =
(ODc - ODt)
Trong đú: M: Hàm lượng chất phõn tớch cú trong 0,01ml mẫu ODc: Mật độ quang mẫu chuẩn
ODt: Mật độ quang mẫu trắng ODm: Mật độ quang mẫu phõn tớch 0,01 là 0,01 gam mẫu chuẩn trờn 1 chấm
Tớnh toỏn nồng độ phần trăm chất phõn tớch cú trong mẫu: M
H (%) = x 100 0,01