VẬT LIỆ UỜ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1.Xác ựịnh hoạt tắnh enzyme chitosanase bằng phương pháp quang phổ sử dụng acid dinitrosalicylic DNS
dụng acid dinitrosalicylic DNS
Nguyên tắc: Khi enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan sẽ tạo các oligosaccharide có ựầu chứa ựường khử D Ờ glucosamine. Phương pháp acid dinitrosalicylic xác ựịnh sự có mặt của nhóm (- CHO) trong ựường khử, oxy hoá nhóm aldehyt trong ựường, ựồng thời 3,5Ờdinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3Ờamino,5Ờnitrosalicylic acid trong môi trường kiềm.
CHO Ờ oxh nhóm COOỜ 3,5 Ờ dinitrosalicylic acid 3Ờamino,5Ờnitrosalicylic acid
Sulfide ựược bổ sung vào phản ứng ựể hấp thụ oxi hoà tan trong môi trường vì oxi hoà tan không cần cho phản ứng màu.
Theo trình tự phản ứng, một phân tử ựường sẽ phản ứng với 1 phân tử DNS. Tác nhân phản ứng DNS gồm:
Nước cất : 1416 ml 3,5 Ờ dinitrosalicylic acid ( C7H4N2O7 ) : 10.6 g
NaOH : 19.8 g
Sau khi hòa tan cho thêm vào dung dịch:
Muối seigntte (KNaC4H4O6. 4H2O) : 306 g Phenol ( C6H5OH ) : 7.6 ml Natri metabisulfit (Na2S2O5) : 8.3 g
Chuẩn 3 ml thuốc thử acid dinitrosallicylic bằng HCl 0.1N với 5 Ờ 6 ml chỉ thị phenolphtalein nếu cần cho thêm NaOH.
Tiến hành:
Cho 2ml DNS + 2ml glucose vào ống nghiệm (ựậy kắn). đun sôi trong 5 phút → dung dịch có màu nâu ựỏ. Làm lạnh ựến nhiệt ựộ phòng.
đo ựộ hấp thụ quang học (Absorbance) ở bước sóng 540nm (A540).
Dựng ựường chuẩn Glucosamine:
Pha dãy glucosamine chuẩn từ 0; 0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.7; 0.8; 0.9; 1mg trong 1ml. Cho 2ml dung dịch glucosamine chuẩn vào một ống nghiệm, thêm 2ml thuốc thử DNS. đun sôi trong 5phút.
Làm lạnh ựến nhiệt ựộ phòng. đo ựộ hấp thụ quang học ở bước sóng 540nm (A540) với ựối chứng là H2O.
Vẽ ựường chuẩn glucosamine với trục tung là ựộ hấp thụ quang học, trục hoành là nồng ựộ glucosamine.
Chuẩn bị mẫu và ựo ựộ hấp thụ quang học của các mẫu enzyme:
Chuẩn bị 2 ống nghiệm, một ống thắ nghiệm, một ống ựối chứng. Lấy 1ml dịch enzyme cho vào mỗi ống, ở ống ựối chứng cho thêm 300 ộl dung dịch NaOH 10N ựể bất hoạt enzyme.
Tiếp theo, thêm vào mỗi ống 3ml dung dịch chitosan 0.2%. đặt 2 ống nghiệm trong bể ổn nhiệt ở nhiệt ựộ 500C trong 20phút. Sau ựó, nhỏ 300 ộl NaOH 10N vào ống thắ nghiệm ựể dừng phản ứng. Thêm vào mỗi ống 2ml DNS, ựặt 2 ống nghiệm trong bể ổn
nhiệt ựun sôi trong 5 phút.
Sau ựó, ựể nguội ựến nhiệt ựộ phòng và ựo A540. Mỗi mẫu ựược làm lặp lại 2 lần. Kết quả hoạt tắnh enzyme ựược tắnh theo phương trình ựường chuẩn.
định nghĩa ựơn vị hoạt tắnh enzyme chitosanase: Một ựơn vị hoạt tắnh enzyme chitosanase là lượng enzyme cần thiết xúc tác phản ứng thuỷ phân chitosan ựể giải phóng ra 1ộmol ựường khử trong thời gian 1 phút ở các ựiều kiện tiêu chuẩn của phương pháp phân tắch.