VẬT LIỆ UỜ NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1.Nghiên cứu phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN
3.3.1.1 Giữ và bảo quản giống
Sau khi thuần giống, giống ựược cấy truyền vào môi trường thạch nghiêng ở 370C ựể giữ giống . Sau khi giống ựã mọc tốt, bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt ựộ 3 Ờ 40C, sau 2 Ờ 3 tuần phải cấy truyền lại một lần.
3.3.1.2 Nuôi cấy
bình lên men vô trùng ựịnh lượng 250ml của hệ thống lên men ựồng thời 3 bình Qplus (đức). Cấy giống ựã hoạt hóa (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ống nghiệm với thể tắch môi trường hoạt hóa 7 ml vào môi trường hoạt hóa ở chế ựộ vô trùng tiến hành trên máy lắc ở chế ựộ 200vòng/phút ở 370C) sau ựó ựược ựưa vào nuôi cấy ở chế ựộ vô trùng với tỷ lệ tiếp giống 5 - 7%.
3.3.1.3 Xác ựịnh ựiều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 bằng bài toán quy hoạch thực nghiệm
Quá trình sinh tổng hợp chitosanase của vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố của quá trình nuôi cấy, trong ựó các yếu tố nhiệt ựộ, pH và nồng ựộ cơ chất chitosanase ảnh hưởng rõ ràng tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase.
Xét ảnh hưởng của ựơn yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng tổng hợp chitosanase:
Ảnh hưởng của nhiệt ựộ:
Thắ nghiệm ựược tiến hành bằng cách thay ựổi nhiệt ựộ từ 25 - 500C với pH bằng 7 và nồng ựộ chitosan 0.2%.
Ảnh hưởng của pH:
Thắ nghiệm ựược tiến hành bằng cách thay ựổi pH từ 4 Ờ 9, với nhiệt ựộ ựã chọn và nồng ựộ chitosan: 0.2%.
Ảnh hưởng của nồng ựộ chitosan:
Thắ nghiệm ựược tiến hành bằng cách thay ựổi nồng ựộ chitosan từ 0.1 Ờ 0.4%, với nhiệt ựộ và pH ựã chọn.
Sau khi xác ựịnh ựược sự ảnh hưởng của các ựơn yếu tố, xác ựịnh các mức cơ sở và cùng khảo sát ựể giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và ựiểm tối ưu cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme cao.
Tiến hành mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 nhằm tổng hợp chitosanase bằng phương pháp phản ứng bề mặt (Response Surface Methodology Ờ RMS).
X1: Nhiệt ựộ (0C) X2: pH
X3: Nồng ựộ cơ chất chitosan (%) Hàm mục tiêu bao gồm:
Y: Hoạt tắnh chitosan (U/ml) Dạng của mô hình:
Với k là yếu tố ảnh hưởng (k=3)
Cách bố trắ thắ nghiệm ựược trình bày dựa trên bảng ma trận thực nghiệm (Bảng 3.1). Sau ựó sử dụng phần mềm JUMP7 giải bài toán mô hình tối ưu hóa ựiền kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1.
Bảng 3.1. Ma trận thực nghiệm
Thắ nghiệm Biến chuẩn
X1 X2 X3 1 +1 +1 +1 2 Ờ1 +1 +1 3 +1 Ờ1 +1 4 Ờ1 Ờ1 +1 5 1 1 Ờ1 6 Ờ1 1 Ờ1 7 1 Ờ1 Ờ1 8 Ờ1 Ờ1 Ờ1 9 +1.68 0 0 10 Ờ1.68 0 0 11 0 +1.68 0 12 0 Ờ1.68 0 13 0 0 +1.68 14 0 0 Ờ1.68 15 0 0 0
Tương ứng mô hình có dạng: Y = b0 + b1*X1 + b2*X2 + b3*X3 + b11*X21 + b22*X22 + b33*X32 + b12*(X1*X2) + b13*(X1*X3) + b23(X2*X3) Trong ựó: b0: Hệ số tự do b1, b2, b3: Hệ số tuyến tắnh b12, b13, b23: Hệ số tương tác ựôi b11, b22, b33: Hệ số bình phương Tiến hành theo 3 yếu tố ảnh hưởng:
X1: Nhiệt ựộ (0C) X2: pH
X3: Nồng ựộ cơ chất chitosan (%) Hàm mục tiêu bao gồm:
Y: Hoạt tắnh enzyme chitosanase (U/ml)
3.3.1.4. Xác ựịnh ựường cong ựộng học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1
đường cong sinh trưởng của vi sinh vật biểu diễn sự biến ựổi của số lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh. Tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng (môi trường nuôi cấy) môi trường với các ựiều kiện tối ưu ựã lựa chọn, với chế ựộ lắc 200 rpm. Cứ sau 6 giờ ta hút dịch cho vào ống nghiệm, tiến hành ựo hấp phụ quang ở bước sóng A620 nm ựồng thời xác ựịnh hoạt tắnh enzyme chitosanase. Từ ựó ta xác ựịnh ựược ựường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis VKNN1 chắnh là sự thay ựổi của ựộ hấp thụ quang học trong quá trình nuôi cấy.
3.3.1.5. Tinh sạch enzyme chitosanase
Dịch enzyme ựược tiến hành tủa phân ựoạn bằng muối amoni sunphate, kết tủa ựược hòa tan trong ựệm acetate 0.05M pH = 5.5 và tiếp tục làm sạch bằng phương pháp loại muối. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Lần lượt khảo sát liên tiếp các phân ựoạn, 0Ờ30%; 30Ờ50%; 50Ờ70%;...; 70Ờ90% bão hòa của muối amoni sunphate với dịch enzyme thô, chọn phân ựoạn thắch hợp ựể làm sạch sơ bộ enzyme.
Chế phẩm enzyme thu ựược bằng phương pháp này chứa nhiều muối vì vậy cần loại muối bằng phương pháp thẩm tắch (dialysis).
Cách tiến hành: Cho dung dịch protein vào túi cellophane, sau ựó ựặt cả túi vào dung dịch ựệm acetate pH 5.5 0.01M trong ựiều kiện 40C trong vòng 24h. Màng cellophane là màng bán thấm, có kắch thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và ựi qua vào các dung dịch ựệm loãng theo ựịnh luật khuếch tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn.
Phân chia hỗn hợp Protein bằng sắc ký cột DEAE cellulose:
Cách tiến hành:
Chuẩn bị cột: Trong thắ nghiệm này, chúng tôi sử dụng cột sắc ký trao ựổi ion là HiPrep DEAE FF 16/10. Với Gradient NaCl (0 Ờ 1M).
Chuẩn bị dung dịch ựệm:
Dung dịch A: dung dịch ựệm acetate 0.05M, pH 5.5 gồm hai thành phần CH3COOHvà CH3COONa.
Dung dịch B: dung dịch A bổ sung thêm lượng muối NaCl 1M.
Chuẩn bị mẫu: mẫu enzyme chitosanase sau khi tinh sạch bằng phương pháp tủa phân ựoạn amoni sunphate và ựã qua thẩm tắch.
Quy trình thực hiện:
Kết nối các bộ phận của hệ thống và thiết lập quy trình, sau ựó dùng syringe bơm mẫu vào máy. Hệ thống sẽ thưc hiện quá trình phân chia, vẽ sắc ký ựồ trên màn hình theo dõi, và tiến hành thu mẫu tự ựộng bằng máy thu gom tự ựộng fraction collector.
Kết thúc quy trình, ta ghi nhận ựược tất cả các thông số về các pic tách ra ựược trên màn hình. để thu ựược kết quả tốt nhất, nên gom các ống từng pic ựể xác ựịnh hàm lượng protein và hoạt tắnh enzyme.
Các thông số của quá trình sắc ký trao ựổi ion như sau: Cột: DEAE FF (GE Health care, Sweden)
Tốc ựộ dòng chảy: 2ml/phút
Hệ dung môi: ựệm acetate 0.05M, pH=5.5; rửa giải với gradient 0 - 1M NaCl Detector: UV, bước sóng 280 nm
Tiếp tục thu nhận các pic thể hiện hoạt tắnh chitosanase cao, thực hiện ựiện di ựể kiểm tra ựộ sạch và thực hiện sắc ký trao ựổi ion lần thứ hai nếu thấy cần thiết.
3.3.1.6. Xác ựịnh ựộ tinh sạch của enzyme chitosanase
Khảo sát thành phần protein - enzyme ngoại bào tổng số bằng phương pháp ựiện di SDS-PAGE 3 lớp (4, 10 và 16,5%) theo phương pháp của Schảgger và Von Jagow (1987).
Kắch thước bản gel 8 x 8.5 cm. Mẫu ựược trộn với ựệm mẫu SDS, ủ tại 950C trong 5 phút, ly tâm 7000vòng/phút trong 5 phút, nhỏ 20ộl vào giếng, Gel ựược chạy bằng máy ựiện di Consort EV222 tại 100V trong 5 phút ựầu ựể tải mẫu vào gel, sau ựó chạy ở 150V trong 2h.
Gel ựược nhuộm bằng Coomassie (0.1% Coomassie Blue G250, 40% methanol, 10% acetic acid, 50% nước cất) qua ựêm và tẩy bằng dung dịch tẩy nhuộm (50% nước cất, 40% methanol, 10% acetic acid) cho ựến khi nền bản gel trắng sạch.
Bảng 3.2. Thành phần bản ựiện di theo phương pháp Schảgger và Von Jagow (1987) cho 2 bản gel
Hóa chất 16.5% 10% 4% Acrylamide (ml) 4.392 1.33 0.535 Gel buffer (ml) 2.669 1.33 0.969 Nước (ml) 1.34 2.996 Glyxerol 87% (ml) 0.944 APS (ộl) 26.64 15 31.25 TEMED (ộl) 2.669 1.5 3.125
3.3.1.7 Xác ựịnh tắnh chất của enzyme chitosanase
- Ảnh hưởng của nhiệt ựộ và pH tới hoạt tắnh của enzyme
Hoạt tắnh enzyme cũng ựược ựo trong môi trường phản ứng có pH khác nhau (pH 4 Ờ 9), sử dụng các ựệm acetate (pH 4 Ờ 6), ựệm phosphate (pH 6 Ờ 8), ựệm Tris (pH 7 Ờ 9),
nhiệt ựộ phản ứng 500C. Từ ựó xác ựịnh ựược pH thắch hợp cho enzyme hoạt ựộng.
Hoạt tắnh enzyme chitosanase ựược xác ựịnh tại các nhiệt ựộ khác nhau (30 Ờ 900C) ở pH tối ưu ựã xác ựịnh dưới các ựiều kiện xác ựịnh hoạt tắnh enzyme. Từ ựó xác ựịnh ựược nhiệt ựộ thắch hợp cho enzyme hoạt ựộng.
-Ảnh hưởng của nhiệt ựộ và pH tới tắnh ổn ựịnh của enzyme
Chitosanase trước khi tiến hành phản ứng với cơ chất sẽ ựược ủ tại các ựiều kiện về nhiệt ựộ hay pH khác nhau trong 1h (30 Ờ 900C và pH 4 Ờ 9). Sau ựó tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh enzyme theo các bước ựã xác ựịnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
-Ảnh hưởng của một số ion kim loại tới hoạt tắnh của enzyme
Trước khi tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh của enzyme, ủ enzyme với các muối chứa ion kim loại với nồng ựộ 1mM và 10mM trong 1h, sau ựó tiến hành xác ựịnh hoạt tắnh của enzyme.
Các muối chứa ion: Cu2+, Mg2+, Al3+, Fe2+, Fe3+, Zn2+, K+, Ca2+