Các mẫu cao khô tổng số được pha loãng và chạy sắc ký cột trong hệ đệm môi n-hexane: ethyl acetate (7 : 3). Các phân đoạn ra khỏi cột được kiểm tra bằng TLC (Hình 19).
Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương
Hình 19. Sắc ký đồ các phân đoạn của mẫu Hồ tiêu 5 (T5) (UV 365 nm)
Khi quan sát bản TLC dưới tia UV bước sóng 365 nm, có thể thấy băng Piperine với màu xanh dương rõ nét, tương tự kết quả TLC dịch chiết tổng số. Tuy nhiên, ở cả chất chuẩn và các phân đoạn, ngay bên trên băng Piperine còn xuất hiện 1 băng vàng mờ. Trong quá trình chạy sắc ký cột, chúng tôi đã thay đổi nhiều hệ dung môi khác nhau nhưng không thể tách hoàn toàn 2 băng này. Do vậy, chúng tôi bước đầu nhận định băng màu vàng là một loại alkaloid dạng Piperine, có khối lượng, cấu trúc, tính chất tương đối giống với Piperine. Chúng tôi đã thu các phân đoạn chứa 2 băng Piperine không lẫn tạp chất và các phân đoạn chứa 2 băng có lẫn tạp chất. Với các phân đoạn 2 băng lẫn tạp chất, chúng tôi tiến hành bay hơi dung môi và chạy cột lần 2 để thu được lượng Piperine tối đa. Sử dụng công thức 3 (Chương 2), chúng tôi tính toán được hàm lượng Piperine thu được qua sắc ký cột (Bảng 3).
Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương
Bảng 3. Hàm lƣợng Piperine trong các mẫu Hồ tiêu thông qua định lƣợng bằng sắc ký cột
STT Mẫu Khối lƣợng mẫu
(mg) Khối lƣợng Piperine (mg) C2 – Hàm lƣợng Piperine (%) 1 T1 300 0.53 0.178 2 T2 300 0.77 0.255 3 T3 300 0.59 0.196 4 T4 300 0.47 0.158 5 T5 300 0.62 0.205
Kết quả này là hoàn toàn phù hợp với việc bán định lượng bằng sắc ký bản mỏng ở trên với hàm lượng Piperine cao nhất trong mẫu T2 (0.255%) và thấp nhất trong mẫu T4 (0.158%). Có sự sai khác giữa lượng cao khô tổng số thu được và hàm lượng Piperine tương ứng là do hàm lượng các chất có trong các mẫu Hồ tiêu khác nhau. Vì vậy để khai thác có hiệu quả Piperine, chúng tôi đề xuất sử dụng các mẫu Hồ tiêu đen thu tại Hòa Bình - Kon Tum.
Để kiểm tra kết quả, chúng tôi tiếp tục tiến hành định lượng và đánh giá độ tinh sạch của mẫu Piperine tinh sạch thông qua sắc ký hiệu năng cao HPLC.