Để xác định sự có mặt cũng như chỉ số Rf của Piperine và điều kiện chạy sắc ký cột, chúng tôi tiến hành phân tích dịch chiết tổng số bằng sắc ký bản mỏng với các hệ dung môi với độ phân cực khác nhau là ethanol : n - hexane : ethyl acetate và n - hexane : ethyl acetate. Bản TLC được quan sát dưới tia UV có bước sóng 254 nm và 365 nm (Hình 16, 17). 0 2 4 6 8 10 12 T1 T2 T3 T4 T5 % Hàm lƣợng cao khô QT1 QT2
Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương
Hình 16. Sắc ký đồ các mẫu Hồ tiêu trong ethanol : n-hexane : ethyl acetate (trái )và n - hexane : ethyl acetate (phải) (UV 254 nm)
Hình ảnh sắc ký đồ cho thấy, đối với hệ dung môi ethanol : n - hexane : ethyl acetate, các chất có trong mẫu dịch chiết tổng số chạy nhanh, không phân tách thành các băng rõ rệt, vì vậy không thể xác định có Piperine trong mẫu dịch chiết tổng số hay không. Đối với hệ dung môi n - hexane : ethyl acetate, các băng phân tách rõ ràng, xuất hiện băng Piperine ở vị trí tương ứng với chất chuẩn, có màu sắc đậm nét. Ngoài ra còn xuất hiện nhiều băng phụ tương ứng với các chất khác có nồng độ thấp hơn hẳn so với Piperine. Tuy nhiên vị trí các băng tương đối gần nhau, đây cũng là một khó khăn cho quá trình tinh sạch. Các băng tương ứng với Piperine ở các mẫu dịch chiết tổng số có độ đậm gần như nhau, đậm nhất ở mẫu T2 và nhạt nhất ở T4. Từ đó có thể bán định lượng rằng hàm lượng Piperine ở mẫu T2 là cao nhất và ở mẫu T4 là thấp nhất. Kết quả bán định lượng trên sẽ được kiểm tra lại thông qua HPLC.
Khi quan sát bản TLC dưới UV có bước sóng 365 nm, các băng tương ứng với các chất thể hiện bằng các màu sắc khác nhau dễ nhận biết: Piperine có màu xanh dương đậm, các băng tạp chất có màu vàng, xanh hoặc đỏ. So sánh kết quả này với kết quả nghiên cứu của Adelia Grzybowski và cộng sự (2012) ta nhận thấy có nhiều điểm tương đồng. Adelia Grzybowski tiến hành thu dịch chiết tổng số
Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương bằng dung môi ethanol và sắc ký bản mỏng với hệ dung môi n - hexane: chloroform : nitroethane : ethyl acetate : acetone : methanol : acetonitrile : nước ( 12 : 2 : 4 : 4 : 1 : 2: 1.6 : 0.1). Bản TLC được nhuộm với thuốc thử anisaldehyde, sấy nóng và quan sát dưới tia UV có bước sóng 365 nm. Kết quả cho thấy, Piperine là thành phần chính và hiển thị bằng màu xanh lá cây đậm. Số lượng và màu sắc các băng tạp chất cũng tương ứng với kết quả nghiên cứu [10].
Hình 17. Sắc ký đồ các mẫu Hồ tiêu trong n - hexane : ethyl acetate (trái) hexane : chloroform : nitroethane : ethyl acetate : acetone : methanol :
acetonitrile : nƣớc (phải) [46]
Như vậy, mặc dù không sử dụng phương pháp nhuộm, bằng việc sử dụng hệ dung môi n - hexane : ethyl acetate, chúng tôi đã phân tách được các băng tương ứng với các chất khác nhau có mặt trong dịch chiết tổng số Hồ tiêu. Để chọn được tỷ lệ dung môi tốt nhất, chúng tôi tiến hành TLC mẫu T1 và chất chuẩn trong hệ dung môi n - hexane : ethyl acetate với 3 tỷ lệ: 9 : 1, 8 : 2, 7 : 3. Sắc ký đồ thu được thể hiện ở Hình 18.
Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương
Hình 18. Sắc ký đồ mẫu Hồ tiêu 1 (T1) trong hệ dung môi n-hexane : ethyl acetate với tỷ lệ a) 9 : 1 b) 8 : 2 c) 7 : 3 (UV 254 nm)
Trong 3 tỷ lệ thử nghiệm, hai tỷ lệ 9 : 1 và 8 : 2 các băng đã phân tách nhưng khoảng cách giữa các băng chưa rõ ràng, gây khó khăn cho quá trình tinh sach. Vơi tỷ lệ 7 : 3, các băng phân tách tốt, băng tương ứng với Piperine có Rf = 0.41 ± 0.05, tách biệt với các băng tạp chất. Tùy thuộc vào hệ dung môi TLC mà tỷ lệ Rfcó thể thay đổi. Với hệ dung môi toluene : ethyl acetate (2 : 1), Rf của Piperine là 0.518 [19], với hệ dung môi hexane : chloroform : nitroethane : ethyl acetate : acetone : methanol : acetonitrile : nước (12 : 2 : 4 : 4 : 1 : 2 : 1.6 : 0.1) Rf của Piperine là 0.6 [46]. Với những kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate (7 : 3) để làm hệ dung môi chạy sắc ký cột.