Sau khi đã xác định được sự có mặt của Piperine trong các mẫu cao khô tổng số thông qua TLC, chúng tôi tiến hành sắc ký cột nhằm phân lập Piperine. Các mẫu cao khô tổng số được pha với nồng độ đậm đặc 100 mg/ml. Dung dịch đệm được sử dụng để chạy cột là n – hexane : ethyl acetate (7 : 3).
Silicagel (kích thước 0.04 - 0.063 mm) được ngâm trong nước cất để trương nở hoàn toàn. Sau một thời gian, loại bỏ lớp nước trên bề mặt, chuyển gel vào ngâm trong dung dịch đệm và tiến hành loại bọt trong gel. Cột gel được dựng thẳng đứng,
Rf = l
Luận văn Thạc sỹ Nguyễn Thị Thu Hương bổ sung một lượng đệm trước khi nhồi cột. Gel được rót từ từ vào cột, tránh tạo bọt và phân lớp. Nhồi gel cho đến khi cột đạt được chiều cao khoảng 30cm thì dừng lại, bổ sung 2 lần thể tích đệm chạy qua cột để cột được đồng nhất.
Khi dung môi phía trên cột còn cách mặt cột khoảng 2 cm, sử dụng pipet hút mẫu cho đều lên bề mặt cột, tránh làm xáo động mặt cột. Để dung dịch mẫu ngấm dần xuống cột đến bề mặt thì bổ sung đệm chạy cột, điều chỉnh tốc độ dòng chảy cho phù hợp. Thu các phân đoạn chảy ra khỏi cột vào ống nghiệm, mỗi ống thu 2 - 3 ml. Sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra các phân đoạn ra khỏi cột, thu các phân đoạn chỉ chứa Piperine. Các phân đoạn chứa Piperine và tạp chất được thu lại và chạy cột lần 2 để thu được lượng Piperine tối đa. Dung dịch chứa Piperine được đem đi cô quay để thu cao khô.
Hàm lượng Piperine thu được thông qua sắc ký cột được tính toán theo công thức 3 (CT3).
(CT3) Trong đó:
C2 là hàm lượng Piperine thu được trong 5g mẫu Hồ tiêu qua sắc ký cột (%). a là khối lượng Piperine tinh sạch thu được (mg).
b là khối lượng mẫu khô đưa vào cột (mg).