Qua nhiều năm, đã có sự quan tâm đáng kể của các nhà khoa học đến các vật liệu polymer ưa nước, vật liệu polymer sinh học. Các vật liệu này có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong y học. Đóng vai trò như là vật mang thuốc đến các địa điểm cần điều trị trên cơ thể. Đồng thời kiểm soát được thời gian phóng thích thuốc, nhằm mục tiêu giảm tác dụng phụ không mong muốn và tăng cường hiệu quả điều trị.
Theo truyền thống, polymer mạch thẳng, ưa nước đã được nghiên cứu khảo sát thử nghiệm dùng cho các ứng dụng làm vật liệu mang thuốc. Nhưng với sự xuất hiện của polymer dendrimers, được các nhà khoa học đánh giá cao vì phân tử phân nhánh, với kích thước, cấu trúc hình dáng và các nhóm chức bề mặt, ta có thể kiểm soát trong quá trình tổng hợp, sao cho tương hợp với tế bào cơ thể. Những tính chất đặc biệt đó đã cung cấp một cơ hội tuyệt vời để thiết kế các vật liệu mang các loại thuốc mới. PAMAM dendrimers là loại polymer dendrimer hoàn chỉnh đầu tiên được tổng hợp, xác định tính chất và được thương mại hóa. Trải qua nhiều nghiên cứu sinh học, có sử dụng PAMAM dendrimers đều cho kết quả rất khả quan. Qua đó đã chứng minh được rằng PAMAM dendrimers thế hệ G2 đến G4 không độc đối với cơ thể người, do đó có tiềm năng rất lớn trong ứng dụng làm vật mang thuốc.
Các loại thuốc chống ung thư, cụ thể là các phức chất platinum thể hiện mạnh hoạt động chống ung thư, đặc biệt nổi bậc là cisplatin, carboplatin và muối K2PtCl4…Các loại thuốc này được sử dụng rộng rãi trong điều trị ung thư tinh hoàn, ung thư buồng trứng, ung thư phổi, ung thư bàng quang, ung thư đầu và cổ... Tuy nhiên, tác dụng phụ của chúng trên thận là nhược điểm chính của các hợp chất phức này đối với các ứng dụng lâm sàng trong việc điều trị. Chính vì thế các nhà khoa học nghiên cứu dùng PAMAM dendrimer làm vật liệu mang các loại thuốc này. Các thí nghiệm nghiên cứu mô phỏng phân tử cho rằng thế hệ cao PAMAM dendrimers được cấu trúc cầu dày đặc không phù hợp cho việc dùng làm tác nhân mang thuốc. Những quan sát này cho thấy các PAMAM dendrimer G2 đến G4 có kích cỡ phù hợp được dùng làm vật mang thuốc platinum có tác dụng đặc trị bệnh ung thư. Các phức phối hợp của platinum với các PAMAM dendrimer
tạo nên một tác nhân có hiệu quả trong đặc trị bệnh ung thư. Sự kết hợp này tạo nên các hợp chất thuốc mới có tính hòa tan tốt trong nước, hạn chế liều dùng và có đặc tính phản ứng tốt hơn so với những thuốc platinum cổ điển.
3.3. LÝ THUYẾT VỀ SỰ TỔNG HỢP PHỨC PAMAM DENDRIMER-PLATINUM. 23
Trong khoảng mười năm gần đây, PAMAM dendrimers đã được sử dụng để làm chất trung gian trong sự tổng hợp kim loại chuyển tiếp nano. Nhìn chung sự lựa chọn thích hợp các thế hệ của PAMAM dendrimers và tỷ lệ kim loại với dendrimer, và các biến đổi tổng hợp khác có ảnh hưởng đến sự hình thành tỉ lệ kim loại trong dendrimer. Nhiều nhóm nghiên cứu đã đi một bước xa hơn, sử dụng các hạt nano PAMAM dendrimers ổn định để làm chất xúc tác cho một loạt phản ứng hữu cơ. PAMAM dendrimers chứa các hạt nano Pt đầu tiên được nghiên cứu bởi nhóm của Crooks cùng các cộng sự và chủ đề này các năm gần đây thu hút rất nhiều các nhóm nghiên cứu. Phương pháp tổng hợp được tiến hành gồm 2 bước:
Bước đầu tiên là chúng ta tạo phức giữa PAMAM dendrimer với ion Pt2+ Bước tiếp theo là ta khử ion Pt2+ thành kim loại Pt ở dạng nano.
Nhưng trong phần này chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu các quá trình xảy ra phản ứng ở bước một. Trong bước này chúng tôi tạm thời chia thành hai giai đoạn.
Giai đoạn đầu là sự thủy phân các muối platinum và cisplatin nhằm tạo ra các phối tử và các cation hoạt động. Để hiểu rõ cơ chế và quá trình động học phản ứng, Crooks cùng các cộng sự tiến hành khảo sát và nhận định sau: Sự thủy phân muối platinum K2PtCl4 nhằm tạo ra các tác nhân phản ứng có phối tử hoạt động hơn.
PtCl42- + H2O PtCl3(H2O)1- + Cl- PtCl3H2O1- + H2O PtCl2(H2O)2 + Cl- Còn quá trình thủy phân cisplatin tạo ra các cation hoạt động.
cis – Pt(NH3)2Cl2 + H2O cis – Pt(NH3)2Cl(H2O)+ cis – Pt(NH3)2Cl(H2O)+ + H2O cis – Pt(NH3)2(H2O)22+
Sản phẩm của phản ứng thủy phân phụ thuộc nhiều vào nồng độ của muối K2PtCl2 hay nồng độ của cisplatin. Họ nhận thấy rằng, ở nồng độ [K2PtCl4] <1,0 mM, hầu như tất cả các PtCl42- bị thủy phân để tạo ra một hỗn hợp của PtCl3(H2O)1- và PtCl2(H2O)2- còn khoảng [K2PtCl4] <10.0 μM chưa bị thủy phân. Đối với nồng độ [K2PtCl4] >1,0 mM, hơn 10% PtCl42- vẫn không bị thủy phân, và tỷ lệ nồng độ [K2PtCl4] trong dung dịch tăng dần vì phản ứng thủy phân là thuận nghịch. Nhóm này cho rằng PtCl42- bị thủy phân hoàn tất trong khoảng 6 giờ và đạt cân bằng trong khoảng 1 ngày, thông qua phương pháp chuẩn độ axit và kết quả sắc ký trao đổi ion. Do đó, số lượng tương đối của các tiểu phân PtCl42-, PtCl3(H2O)1-, và PtCl2(H2O)2 trong dung dịch không chỉ phụ thuộc vào nồng độ của [K2PtCl4] mà còn phụ thuộc vào thời gian thủy phân. Vấn đề này được nhóm nghiên cứu hiểu rằng phối tử clo trong muối không bền, dễ thay thế bởi các phân tử H2O ở điều kiện thủy phân.
Giai đoạn tiếp theo là sự tạo phức PAMAM dendrimer-Pt2+. Việc xác định sự trao đổi phối tử hoạt động PtCl42-, PtCl3(H2O)1-, và PtCl2(H2O)2 với dung dịch phản ứng PAMAM dendrimer thế hệ nguyên đã được nhóm nghiên cứu theo dõi thường xuyên bằng phổ UV. Gần đây với sự tiến bộ của khoa học thì sự tạo thành liên kết giữa PtCl42- được theo dõi bằng phổ NMR 195Pt và Extended X-ray absorption fine structure spectroscopy (EXAFS). Dấu hiệu của các phản ứng thể hiện trong quang phổ hấp thụ UV- vis là một tính hiệu phổ đặc trưng cho phối tử của kim loại chuyển tiếp ligand-to-metal charge-transfer (LMCT) tại điểm hấp thụ 200-250 nm. Có nhiều nghiên cứu trước đây cho rằng chiều cao đỉnh LMCT là tỷ lệ thuận với số lượng ion Pt2+ tạo liên kết với PAMAM dendrimer. Sự khảo sát về thời gian cho thấy các phản ứng tạo phức đạt trạng thái ổn định ít nhất từ 4 giờ đến nhiều nhất là 2 ngày. Họ nói rằng các phổ NMR và EXAFS cho kết quả thấy phức của muối Pt có thể thay đổi đến ba phối tử clo hoặc phối tử H2O với các nguyên tử N của PAMAM. Phần lớn xảy ra sự tạo phối trí qua nguyên tử N bậc 1, ngoài ra còn tạo được liên kết phối trí qua nguyên tử N của nhóm amide trong phân tử PAMAM dendrimer. Liên kết cộng hóa trị của Pt với nguyên tử N của PAMAM dendrimer tương đối bền. Điều đó cho thấy liên kết phối trí giữa Pt-N mạnh hơn rất nhiều so với liên kết phối trí Pt-Cl và phối tử amine được xem như trơ hơn so với các phối tử Cl– và phối tử H2O. Sự tạo thành liên kết phối trí giữa ion Pt2+ với PAMAM dendrimer
phụ thuộc vào nhiều yếu tố bao gồm: tỉ lệ phản ứng giữa phức Pt: PAMAM, thế hệ PAMAM dendrimer, nồng độ PAMAM, pH và nồng độ các ion khác.
Còn phản ứng thủy phân của các phân tử cisplatin tạo ra các cation hoạt động Pt(NH3)2Cl(H2O)+, Pt(NH3)2(H2O)22+. Các cation này phản ứng với các PAMAM denddrimer thế hệ bán nguyên có nhóm bề mặt là các este. Các nhóm bề mặt của các PAMAM dendrimer phải được chuyển hóa thành các ion cacboxylat, khi đó các ion này dễ tham gia phản ứng với các cation của cisplatin. Bản chất của phản ứng gần giống như phản ứng của axit – bazơ Lewis. Ngoài ra các cation của cisplatin cũng có thể tạo liên kết phối trí với các nguyên tử N trong các nhóm amide của phân tử PAMAM dendrimer. Nhưng phản ứng này tương đối khó xảy ra đối với các thệ hệ cao của PAMAM vì yếu tố không gian.
Tóm lại, 100% liên kết cộng hóa trị của Pt sẽ không thể đạt được nếu tỷ lệ Pt2+ và PAMAM là như nhau. Các liên kết cộng hóa trị của nguyên tử trung tâm Pt2+ với PAMAM dendrimer được qui cho liên kết giữa Pt:N ít hơn so với sự hiện diện của nguyên tử N trong PAMAM dendrimer. Chúng tôi hy vọng rằng trong điều kiện tương lai, việc tạo phức giữa nguyên tử trung tâm Pt2+ và PAMAM dendrimer sẽ được nghiên cứu nhiều hơn để tìm điều kiện tối ưu nhằm nâng cao hiệu suất của phản ứng.
3.4. THUẬN LỢI CỦA VIỆC SỬ DỤNG POLYAMIDOAMINE DENDRIMER SO VỚI POLYMER MẠCH THẲNG LÀM CHẤT MANG THUỐC.20
Việc sử dụng polyme làm vật liệu mang thuốc, đặc biệt là những loại thuốc có tính hòa tan trong nước thấp, có tính độc hại đối với cơ thể hoặc không thể kiểm soát liều lượng trong điều trị, đã đạt được quan tâm nghiên cứu trong những năm gần đây. Một polymer dùng làm chất mang thuốc chống ung thư phải cung cấp một loạt các lợi ích cho việc dùng thuốc này như: kiểm soát được liều lượng, cải thiện tính hòa tan, tính độc của thuốc khi điều trị với liều cao và dễ đào thải ra ngoài cơ thể. Triển vọng của việc sử dụng polyme dendrimer phục vụ cho việc mang thuốc trước đây đã được đề xuất dựa trên cấu trúc độc đáo và đặc tính của phân tử. Sự ra đời của Polymer này chứa rất hứa hẹn cho việc
phát triển phương pháp mới trong việc kiểm soát và phân phát thuốc đúng liều, đúng mục tiêu điều trị. Tuy nhiên, việc sử dụng các polymer dendrimer phục vụ có hiệu quả, làm tác nhân mang thuốc chống ung thư mà trước đây đã không được chứng minh. Một số hợp chất có chứa platinum, đặc biệt là cisplatin, các muối platinum và carboplatin đã được sử dụng trong điều trị ung thư buồng trứng, ung thư phổi, ung thư tinh hoàn, ung thư vú, ung thư dạ dày và ung thư hạch. Tuy nhiên, do độc tính không rõ ràng và khả năng hòa tan trong nước kém của các hợp chất phức platinum vì thế việc dùng cisplatin, muối K2PtCl4 và carboplatin để điều trị bệnh ung thư có nhiều hạn chế. Để khắc phục các nhược điểm này, các nhà khoa học trước đây đã có ý định sử dụng polymer mạch thẳng làm vật liệu mang các loại thuốc này. Nhưng việc sử dụng polyme mạch thẳng phục vụ trong các hệ thống phân phối thuốc có nhiều bất lợi. Một bất lợi lớn với việc dùng polymer mạch thẳng làm vật mang thuốc là chúng không đồng nhất (heterogenous) về cấu trúc, khối lượng phân tử polymer không xác định, giới hạn về số lượng các nhóm chức bề mặt bên ngoài hoặc vị trí thâu tóm thuốc không ổn định. Ngoài ra thành phần cấu tạo của polymer mạch thẳng không được đánh giá cao vì cấu trúc phân tử không xác định. Điều đó gây nhiều khó khăn để cố định tính chất phân phối thuốc, ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị. Từ những hạn chế đó của polymer mạch thẳng mà Food and Drug Administration (FDA) không chấp thuận sử dụng polymer mạch thẳng làm vật mang thuốc. Vì vậy, việc lựa chọn polymer làm vật mang thuốc sẽ được quan tâm và đánh giá cao. Các nhà khoa học luôn tìm kiếm và khám phá các Polymer mang thuốc mới có tác dụng làm cho thuốc tăng cao hiệu quả, có khả năng mang thuốc tốt, độ hòa tan nước tốt, sự ổn định tốt về lưu trữ, độc tính giảm, và các hoạt động chống khối u trong cơ thể được cải thiện. U. S. Pat. Số 5.338.532 đưa ra polymer kết hợp gọi là polymer sao. Đặc điểm của loại polymer này là nhân (core) liên kết với một số nhóm mang dày đặc trên bề mặt ngoài. Một loại polyme sao ra đời có tên là Starburst® polymer, sản phẩm của Công ty Hóa chất Dow. Chính nơi đây polymer dendrimer được định nghĩa là một PAMAM dendrimer. Một loạt các ứng dụng thích hợp cho loại polymer đó được thảo luận rộng rãi tại Mỹ. Bao gồm cả việc sử dụng các PAMAM dendrimer này như một vật liệu mang các tác nhân hoạt động sinh học. U. S. Pat. Số 5.338.532 còn yêu cầu việc sử dụng các PAMAM dendrimer này như
vật mang các tác nhân chống ung thư như cisplatin, carboplatin, dichloride titanocene và diorganotin anitneoplactic dihalides hoặc các tác nhân khác.
Ngoài ra U.S. Ser. No. 09/111,232 còn công bố một số bài viết, đã được xuất bản trong bài báo “Detidrimer-platinate: a Novel Approach to Cancer Chemotherapy", Anti- Cancer Drugs, 10, 767-776 (1999). Bài báo này cũng giới thiệu sự hình thành một phức PAMAM dendrimer-cisplatin liên hợp. Mặc dù chính cisplatin là một tác nhân chống ung thư, nhưng nếu dùng để điều trị độc lập thì sẽ có nhiều tác dụng phụ. Phương pháp mang thuốc này phải làm sao cho các phân tử thuốc chống ung thư như cisplatin, carboplatinum và các phức platinum khác gắn vào cấu trúc phân tử PAMAM dendrimer và khả năng phóng thích thuốc đúng mục tiêu cần điều trị.
3.5. KHẢ NĂNG CHỐNG UNG THƯ CỦA PAMAM DENDRIMER-CISPLATIN. 10
Việc sử dụng hợp chất phức platinum làm thuốc điều trị ung thư tinh hoàn, buồng trứng, bàng quang, ung thư phổi, ung thư đầu và cổ đã được sử dụng rộng rải. Tuy nhiên, các tác dụng phụ nghiêm trọng đi kèm với các loại thuốc này rất lớn. Đều đó đã thúc đẩy các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu khám phá ra các hợp chất mới, các chất mang thuốc mới phục vụ cho nhu cầu chữa bệnh. Hiện đã có rất nhiều sự quan tâm để tiếp tục nghiên cứu, phát triển các polymer ưa nước, vật liệu polymer sinh học có thể phục vụ như là vật mang thuốc đến các vị trí đặc biệt trên cơ thể và đồng thời kiểm soát thời gian phóng thích thuốc, nhằm để giảm bớt tác dụng phụ không mong muốn và nâng cao hiệu quả điều trị của thuốc. Các nhà khoa học luôn cố gắng nghiên cứu tìm ra các vật liệu mới đóng vai trò vận chuyển thuốc. Họ cho rằng đối với chất mang thuốc có trọng lượng phân tử cao cung cấp lợi thế hơn các hợp chất khối lượng phân tử thấp, vì phù hợp với kích cở của khối u cần điều trị. Việc sử dụng sản phẩm polymer dendrimer nhằm đem lại thuận lợi như: trong cơ chế hấp thu nội độc tố (endocytotic) tế bào, thuốc được gắn vào polymer dendrimer có thể tăng khả năng gây độc tế bào ung thư, khắc phục tính tan trong nước đồng thời giảm độc tính của thuốc. Như đã nói ở trên, sự ra đời của PAMAM dendrimers được đánh giá cao vì có cấu trúc nhánh phân tử, có các lỗ trống bên trong, với sự kiểm soát chính xác hình dạng, kích thước nano và các nhóm chức bề mặt. Cấu trúc đó đã cung cấp một cơ hội tuyệt vời để thiết kế như là một con tàu chuyên chở các loại thuốc mới để phục vụ trong các mục tiêu đặc trị trong y học. Các nghiên cứu lâm sàng đầu tiên của sự phối hợp PAMAM dendrimer-platinate làm vật mang thuốc trong điều trị ung thư đã được báo cáo vào năm 1999. Một thế hệ dendrimer PAMAM có chứa nhóm mặt carboxylate được xử lý bằng cisplatin, để tạo ra phức PAMAM dendrimer-platinate. Phức này có khả năng hòa tan rất tốt trong nước, có khả năng gây độc tế bào cao. Sự phân tích quang phổ sắc ký lọc gel (Size exclusion chromatography) (GPC) và kích thước hạt đã cho thấy rằng PAMAM - cisplatin liên hợp được hình thành thông qua một số liên kết phối trí của nguyên tử trung tâm platinum với nhóm carboxylate. Chính điều này là nguyên nhân gây ra sự gia tăng kích thước phân tử của các PAMAM dendrimer mang theo thuốc từ 3-4 nm làm cho đường kính các phân tử PAMAM dendrimer-cisplatin tăng lên đến 30 và 40 lần
so với đường kính của các PAMAM dendrimer ban đầu phù hợp với mục tiêu sử dụng. Do đó, các hợp chất platinum bao gồm một số hợp chất platinum có cấu trúc cis đã được sử dụng liên hợp với polymer làm chất mang thuốc hay còn gọi là polymer thuốc.
Nhiều thí nghiệm khảo sát đối với các dendrimer-cisplatin và cisplatin được thực hiện, kết quả cho thấy có hoạt động chống lại tế bào bạch cầu L1210 trên người là như