- Khuếch tán là sự chuyển động của các tiểu thể (phân tử, ion..) của chất phân tán từ nơi có nồng độ cao đến nơi có nồng độ thấp hơn cho đến lúc cân bằng nồng độ.Thẩm thấu là hiện tượng khuếch tán mà trên đường di chuyển các phân tử của vật chất đang khuếch tán gặp phải một màng ngăn.
Sơ đồ màng ngăn sử dụng đo hệ số khuếch tán [88] như sau:
Hình 2.2 Sơ đồ màng ngăn sử dụng đo hệ số khuếch tán axit salixylic (SA)
Trong ngăn có 2 khoang ngăn cách bởi màng PVA/TB dày 0,2 mm. Màng PVA/TB được ngâm trong nước 2 giờ trước khi thí nghiệm. Ở khoang đầu tiên chứa 10ml dung dịch SA(8mg/10ml), ở khoang thứ hai chứa 100ml nước cất. Sau đó, khoang thứ nhất hạ xuống sao cho màng polyme chạm đúng chất lỏng khoang thứ hai. Hệ thống được đặt trong một chậu nước có nhiệt độ không đổi (30oC). Một pipet được dùng để lấy mẫu hút 0,5ml dung dịch từ khoang thứ nhất và 1ml mẫu từ khoang thứ hai. Các mẫu thu hồi được thay thế bằng nước cất.
Sau đó, mẫu được đưa đi phân tích bằng máy quang phổ hấp thụ Cintra 40 UV- Visible Spectrometer GBC (Canada) tại Viện Hóa Học- VKHCNVN (18-Hoàng Quốc Việt) ở bước sóng 294nm để xác định nồng độ SA trong các khoang.
Hệ số khuếch tán (D) được tính toán từ các kết quả này. Trong khoảng tốc độ khuấy, giá trị nồng độ trong hai khoang có thể sử dụng để tính hệ số khuếch tán theo phương trình cân bằng sau[88]:
Màng PVA/TB Khoang 1 chứa dung dịch
khuếch tán axit salicylic (SA) Dung dịch axit salicylic
(nồng độ C(mg/ml) Môi trường hòa tan
Trong đó: CD(0) : nồng độ ban đầu của dung dịch trong khoang thứ nhất. CR(0) : nồng độ ban đầu của dung dịch trong khoang thứ hai.
CD(t) : nồng độ của dung dịch trong khoang thứ nhất sau khoảng thời gian t. CR(t) : nồng độ của dung dịch trong khoang thứ hai sau khoảng thời gian t. AH : diện tích cắt ngang khuếch tán hiệu quả của màng PVA/TB.
WH : Bề rộng của màng
V1 : Thể tích của dung dịch trong khoang thứ nhất. V2 : Thể tích của dung dịch trong khoang thứ hai.
2.5.5 Độ thẩm thấu hơi nước của màng PVA/TB
Độ thấm thấu hơi nước được xác định theo tiêu chuẩn ASTM E96.
2.6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU SỰ THỦY PHÂN IN VITRO2.6.1 Chuẩn bị mẫu 2.6.1 Chuẩn bị mẫu
Để nghiên cứu sự phân hủy thủy phân, các mẫu màng đã được chuẩn bị như sau: tiến hành tổng hợp PVA/TB trong dung dịch có nồng độ 0.16g/ml. Sau đó tạo màng bằng cách đổ dung dịch đã pha lên đĩa thủy tinh rồi đem đi sấy ở 60oC ở điều kiện chân không (~120mmHg). Sau khoảng 5 giờ sau khi sấy nước đã bay hết màng PVA/TB hình thành trên đĩa được bóc tách và đem đi sấy khô ở 60oC trong chân không sau 24h trước khi tiến hành nghiên cứu sự phân hủy thủy phân trong in vivo. Đĩa có đường kính là 20mm, mỗi màng tạo thành có khối lượng xấp xỉ 0.5g.
2.6.2 Sự phân hủy thủy phân của vật liệu trong in vitro
Các mẫu chính cho nghiên cứu phân hủy thủy phân chuẩn bị trước được ngâm trong dung dịch muối đệm pH=7,4 tại 37oC. Thành phần dung dịch muối đệm bao gồm: 9 g NaCl; 10,73g Na2HPO4x7H2O; 2,12 g NaH2PO4 được pha trong 1 lít nước cất, pH của dung dịch đệm được điều chỉnh tới 7,4 bằng cách thêm NaOH. Các mẫu thí nghiệm được thực hiện trong 10ml dung dịch muối đệm. Để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn, 1 ml của dung dịch NaN3nồng độ 0,04 % đã được thêm vào. Các mẫu được lắc đều nhẹ nhàng trên máy lắc ngang trong suốt thời gian phân hủy. Sau các khoảng thời gian nhất định là 1, 2, 5, 7 tuần các mẫu được lấy ra phân tích. Để phân tích xác định các sản phẩm phân hủy, 2 ml dung dịch muối đệm đã đặt mẫu được lấy ra phân tích trên thiết bị GC để xác định thành phần phân hủy. Màng polyme còn lại được rửa bằng nước cất và sấy khô trước khi phân tích các thông số khác.
2.6.3 Phương pháp phân tích sắc ký khí
Phương pháp sắc ký khí (GC) được sử dụng để phân tích định lượng các sản phẩm tạo thành từ quá trình phân hủy của màng PVA/TB trong invtro. Các mẫu được phân tích
trên thiết bị GC với cột BD-5MS kích thước 30m x 0,25mm; Heli được sử dụng làm chất mang. Tất cả các mẫu được phân tích theo cùng một chương trình nhiệt của cột, nhiệt độ được giữ ở 40oC trong vòng 10 phút và sau đó cho phép tăng từ 40oC lên 250oC với tốc độ 10oC/phút. Mẫu được bơm vào tại nhiệt độ 200oC.
2.6.4 Phương pháp xác định độ tổn hao khối lượng của vât liệu
Mẫu có dạng hình chữ nhật, kích thước 1 x 12 cm với độ dày 0,4 - 0,6cm được ngâm trong môi trường nước hoặc chôn trong đất, hoặc ngâm trong môi trường chứa vi sinh vật có khả năng phân huỷ. Sau những khoảng thời gian nhất định, lấy mẫu, rửa sạch, sấy chân không ở 600C trong 24 giờ, cân mẫu trên cân phân tích để xác định tổn hao trọng lượng.
Độ tổn hao khối lượng của mẫu được tính theo công thức:
% tổn hao
khối lượng =
m1- m2
.100 m1
m1: khối lượng mẫu ban đầu, g
m2: khối lượng mẫu sau khi lấy ra khỏi môi trường phân huỷ, g (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.7 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CHỈ TIÊU SINH HÓA2.7.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hàm lượng kim loại nặng 2.7.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu hàm lượng kim loại nặng
Xác định hàm lượng kim loại nặng của vật liệu bao viên theo QCVN 8- 1:2011/BYT. Các mẫu đo hàm lượng kim loại nặng bằng thiết bị hấp thụ nguyên tử VARIAN 240F3AAS Agilent (Mỹ).
2.7.2 Phương pháp thử độ vô khuẩn
Sản phẩm sau khi được đóng gói kín, được khử trùng bằng bức xạ tia γ với liều lượng 15kGy, trong 10 giờ tại trung tâm chiếu xạ Hà Nội (Viện Năng lượng-Viện KH&CNVN), sau đó được đem thử độ vô khuẩn theo dược điển Việt Nam, 2002.
Chuẩn bị mẫu: Các mẫu màng PVA/TB được khử trùng , sau đó được gửi đi kiểm tra độ vô khuẩn theo dược điển Việt Nam IV (2009) tại Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 1 – Số 8 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
2.7.2.1 Môi trường để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trường thioglycolat có thạch: L - Cystin
Natri clorid
0,50 g 2,50 g
Natri thioglycolat (hoặc acid thioglycolic 0,3 ml) Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha)
Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,10,2
0,50 g 1,0 ml 1000 ml
Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin và natri thioglycolat) trong cối nghiền, thêm vào một ít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích hợp. Thêm số nước còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạo thành dung dịch trong. Thêm natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh sao cho môi trường sau khi tiệt khuẩn có pH 7,10,2.
Đun nóng lại dung dịch (tránh đun sôi). Lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ướt, rồi thêm dung dịch resazurin, trộn đều. Đóng môi trường vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp, hấp vô khuẩn ở 121°C trong 15 phút. Lấy ra làm nguội nhanh tới 25°C, tiếp tục bảo quản ở nhiệt độ 2°C đến 25°C, tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống (hoặc bình) môi trường có màu hồng, môi trường không thích hợp để thử nghiệm. Có thể phục hồi lại môi trường bằng cách đun cách thuỷ cho mất màu rồi làm lạnh đột ngột. Chỉ sử dụng môi trường đã phục hồi này một lần.
Môi trường thioglycolat không có thạch
Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao. L-Cystin
Natri clorid
Dextrose (C6H12O6.H2O)
Cao nấm men(có khả năng tan trong nước) Casein thủy phân bởi pancreatin
Natri thioglycolat
(hoặc acid thioglycolic 0,3 ml) Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha) Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,10,2
0,50g 2,50g 5,50g 5,00g 15,0g 0,50g 1 ml 1000 ml Cách pha chế giống như môi trường thioglycolat có thạch.
2.7.2.2 Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm
Môi trường Soybean - casein
Casein thủy phân bởi pancreatin Bột đậu tương thủy phân bởi papain Natri clorid
17,0 g 3,0 g 5,0 g
Dikali hydrophosphat Dextrose monohydrat Nước
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,30,2 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2,5 g 2,5 g 1000 ml
Hòa tan tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để nguội ở nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxyd 1 N để điều chỉnh (nếu cần) sao cho pH sau khi tiệt khuẩn từ 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho môi trường trong. Phân chia vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 121°C trong 15 phút.
2.7.2.3. Kiểm tra chất lượng môi trường a) Độ vô khuẩn
Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt độ 30°C đến 35°C trong 14 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí; ủ ở nhiệt độ 20°C đến 25°C trong 14 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm. Các loại môi trường phải không được có vi khuẩn, nấm mốc.
Mẫu có độ vô khuẩn đạt tiêu chuẩn nếu so với mẫu chứng không phát hiện các chủng vi khuẩn trên hay xuất hiện nấm mốc.
b) Khả năng dinh dưỡng
Cấy vào môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại vi khuẩn sau:
Loại hiếu khí dùngStaphylococcus aureusATCC 6538.
Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùngBacillus subtilisATCC 6633. Loại vi khuẩn kỵ khí dùngClostridium sporogenesATCC 9404.
Loại nấm dùngCandida albicansATCC 10231, Aspergillus nigerATCC 16404.
Mỗi loại chủng chỉ thị được cấy vào loại môi trường tương ứng, rồi mang ủ ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày đối với nấm. Trên mỗi loại môi trường, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc tốt.
2.8 PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM TRÊN ĐỘNG VẬT2.8.1 Kiểm tra độ kích ứng da 2.8.1 Kiểm tra độ kích ứng da
Mô hình nghiên cứu được thiết kế và tiến hành dựa trên hướng dẫn của OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development: Tổ chức Hợp tác và Phát triển Kinh tế về việc đánh giá kích ứng da dành cho các sản phẩm dược phẩm và mỹ phẩm dùng
2.8.1.1 Nguyên lý thử nghiệm
Thử nghiệm kích ứng trên da là một phương pháp sinh học nhằm đánh giá mức độ phản ứng của da thỏ khi tiếp xúc với mẫu thử. Phép thử được tiến hành trên da thỏ vì thỏ là động vật có da mỏng, tương đối nhạy cảm gần giống với da tay người.
2.8.1.2 Hóa chất, dụng cụ và trang thiết bị
- Tông đơ điện hoặc dụng cụ thích hợp để cạo sạch lông thỏ.
- Kéo, panh, bông và băng dính y tế và dụng cụ gây bỏng chuyên dụng. - Pipet, cốc và các dụng cụ thuỷ tinh.
- Nước cất và các loại dung môi không gây kích ứng.
2.8.1.3 Động vật thí nghiệm
- Thỏ chủng Newzealand White, lông trắng, trọng lượng 1,8-2,5 kg do Trung tâm cung cấp động vật thí nghiệm Đan Phượng – Hà Tây cung cấp.
- Thỏ được nuôi trong phòng thí nghiệm của Bộ môn Dược lý – Trường Đại học Y Hà Nội một tuần trước khi tiến hành nghiên cứu bằng rau và cám thỏ.
2.8.1.4 Tiến hành
- Chuẩn bị động vật thí nghiệm:
Trước ngày thực hiện thử nghiệm (từ 18 đến 24 giờ), cạo sạch lông thỏ ở hai bên sườn (sát vùng cột sống) với diện tích đủ cho thử nghiệm. Số lượng : 3 con. Ký hiệu là thỏ 1; thỏ 2; thỏ 3.
- Gây bỏng thỏ thực nghiệm :Thỏ đuợc cạo sạch lông 2 bên sống lưng với kích thuớc
vùng cạo lông khoảng 12cm mỗi chiều. Cố định thỏ lên bàn chuyên dụng, gây mê bằng dung dịch penthotal 1% với liều 1mL/kg cân nặng theo đuờng tiêm tinh mạch tai. Khi thỏ đã mê, dùng bình nhôm hình trụ đáy phẳng có đuờng kính 3 cm đựng nuớc đang sôi với thể tích hằng định đặt lên vùng da thỏ đã cạo lông và ép với một lực không đổi bằng cách đặt một quả cân 1kg lên miệng bình. Thời gian tiếp xúc với nguồn nhiệt là 35 giây, tạo vết bỏng đuờng kính 3 cm, mức độ tổn thương đuợc đánh giá theo phân loại độ bỏng của Lê Thế Trung(1965).
- Đắp màng PVA/TB đã được khử trùng lên vết bỏng trên lưng thỏ, sau đó được băng (không băng chặt) lại bằng băng gạc.
- Đánh giá và tính điểm các chỉ số về ban đỏ (erythema), phù nề (oedema) tại thời điểm 1 giờ, 24, 48, 72 giờ sau khi loại bỏ màng. Nếu có tổn thương, theo dõi thỏ 14 ngày để đánh giá khả năng phục hồi. Khi tổn thương đã hồi phục thì ngừng theo dõi.
Hình 2.3 Vị trí đặt mẫu màng trên da thỏ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.8.1.5. Quan sát và ghi điểm
- Quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt mẫu thử so với da không đặt mẫu thử ở các thời điểm 24giờ, 48giờ và 72giờ sau khi làm sạch mẫu thử.
- Có thể kéo dài thêm thời gian quan sát khi có tổn thương sâu để có thể đánh giá đầy đủ hơn về khả năng hồi phục hoặc không hồi phục của vết thương nhưng không nên quá 14 ngày. Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo qui định ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 Mức độ phản ứng trên da thỏ
Số tt Phản ứng trên da thỏ Thang điểm
Ban đỏ và sự tạo vẩy
1 Không có ban đỏ 0
2 Ban đỏ rất nhẹ (có thể phân biệt) 1
3 Ban đỏ được nhìn thấy rõ 2
4 Ban đỏ từ mức trung bình đến nặng 3
5 Ban đỏ nặng (màu đỏ thẫm) đến tạo thành vẩy để ngăn ngừa sự tiến triển của ban đỏ.
4
Phù nề
4 Phù nề trung bình (gờ cao khoảng 1 mm) 3 5 Phù nề nặng (gờ cao hơn 1 mm và lan ra xung quanh) 4
Tổng số điểm kích ứng tối đa có thể 8
2.8.1.6 Cách tính kết quả
- Điểm phản ứng trên mỗi thỏ được tính bằng tổng số điểm ở hai mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử.
2. 8.1.7 Cách đánh giá kết quả
Đối chiếu điểm kích ứng với các mức độ qui định trên bảng 2 để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử.
Bảng 2.2Phân loại các phản ứng trên da thỏ
Loại phản ứng Điểm trung bình
Không kích ứng 0
Kích ứng không đáng kể > 0 - 0,5
Kích ứng nhẹ > 0,5 - 2,0
Kích ứng vừa phải > 2,0 - 5,0
Kích ứng nghiêm trọng > 5,0 - 8,0
2.8.2 Đánh giá khả năng hồi phục vết thương
Để đánh giá mức độ phục hồi vết thương của thỏ sau khi sử dụng màng PVA/TB trong điều trị vết thương bị mất da, tổn thương do bỏng, thỏ được chia làm 2 lô, mỗi lô 3 con, mỗi con được nhốt riêng chuồng sau khi được tiến hành gây bỏng thực nghiệm.
- Lô 1: lô chứng: rửa vết thương bằng nước muối sinh lý
- Lô 2: Lô đắp màng PVA/TB (sau 2 ngày thay màng 1 lần, rồi băng lại) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Đánh giá khả năng hồi phục vết thương của màng PVA/TB thông qua tình trạng, sự tiến triển của vết thương, kích thước vết thương sau sau 2 ngày, 4 ngày, 6 ngày, 8 ngày, 10 ngày, 12 ngày, 14 ngày.
2.8.3 Kiểm tra độc tính màng PVA/TB
2.8.3.1 Hóa chất và thiết bị
- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu : ALT (alanin aminotransferase), AST (aspartat aminotransferase), bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol, creatinin của hãng Hospitex Diagnostics (Italy) và hãng DIALAB GmbH (Áo), định lượng trên máy Screen master của hãng Hospitex Diagnostics (Italy).
- Dung dịch xét nghiệm máu ABX Minidil LMG của hãng ABX - Diagnostics, định lượng trên máy Vet abcTMAnimal Blood Counter
2.8.3.2 Tiến hành
Thỏ được chia làm 2 lô, mỗi lô 10 con, mỗi con được nhốt riêng chuồng, được tiến hành gây bỏng thực nghiệm.
- Lô 1: lô chứng: rửa vết thương bằng nước muối sinh lý - Lô 2: Lô đắp màng PVA/TB (sau 2 ngày thay màng 1 lần) Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu:
+ Tình trạng chung, thể trọng của thỏ trước và trong khi đắp màng.
+ Đánh giá chỉ số huyết học thông qua số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu.