Kết quả trình bày ở bảng 3.18 cho thấy, tinh dầu tách chiết từ tế bào và củ nghệ đen tự nhiên đều có khả năng ức chế sinh trưởng của cả 3 loài vi khuẩn: Escherichi coli, Staphylococcus aureus và Bacills cereus. Nhìn chung, tinh dầu thu được từ tế bào nghệ đen có khả năng kháng khuẩn cao nhất thể hiện qua đường kính vòng ức chế (Hình 3.14). Tinh dầu tế bào nuôi cấy ức chế mạnh nhất đối với S. aureus (đường kính vô khuẩn 31 mm), sau đó đến B. cereus (22,33 mm) và kém nhất đối với E. coli (18,33 mm). Trong khi đó, khả năng ức chế sinh trưởng của tinh dầu củ nghệ đen tự nhiên đối với B. cereus và E. coli là tương đương nhau (16 mm và 17,67 mm), kém nhất là đối với S. aureus chỉđạt 14 mm.
Hình 3.14. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu nghệđen. A: E. coli ATCC 25922.
B: B. cereus ATCC 11778. C: S. aureus ATCC 6538. ĐC: đối chứng. TN: tinh dầu củ
78
Bảng 3.18. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu tế bào nghệđen
Đường kính vòng vô khuẩn D-d (mm)
Vi khuẩn
Đối chứng Tinh dầu tế bào Tinh dầu củ nghệ
B. cereus ATCC 11778 0 22,33b 16,00a
E. coli ATCC 25922 0 18,33b 17,67a
S. aureus ATCC 6538 0 31,00a 14,00a
Đối chứng: không có tinh dầu nghệđen
Theo nghiên cứu của nhiều tác giả, vi khuẩn Gram âmthường ít nhạy cảm với hoạt tính của nhiều loại tinh dầu hơn vi khuẩn Gram dương (Dorman 2000; Ruberto và cs 2000; Senatore và cs 2000; Tsigarida và cs 2000). Điều này có thể do sự khác nhau về cấu trúc thành tế bào giữa vi khuẩn Gram âm và Gram dương. Vi khuẩn Gram âmcó lớp màng bao quanh thành tế bào, chính lớp này đã ngăn cản sự khuếch tán của các hợp chất kỵ nước thông qua lớp chất lipopolysaccharide (LPS). Ngược lại, các vi khuẩn Gram dương không có lớp màng này nên tinh dầu có thể tiếp xúc trực tiếp với lớp LSP thành tế bào vi khuẩn, do đó làm tăng khả năng thấm của các ion, sự thất thoát các hợp chất nội bào hoặc làm suy yếu hệ thống enzyme của vi khuẩn (Cowan, 1999; Wendakoon và Sakaguchi, 1995).
Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, các hợp chất thu được từ tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng kháng các loại vi sinh vật. Kết quả nghiên cứu của Paré và cs (1991) cho thấy, hợp chất aurone tách chiết từ tế bào cây
Cephalocereus senilis nuôi cấy huyền phù có khả năng ức chế sinh trưởng của các vi khuẩn Gram âm. Robles-Zepeda và cs (2009) cũng nhận thấy, các chất kháng vi sinh vật (phytoalexin) tách chiết từ tế bào cây xương rồng (Mamillaria huitzilopochitli) nuôi cấy huyền phù có khả năng ức chế sinh trưởng của 8 loài nấm gây bệnh ở thực vật.
Trên đối tượng cây nghệ đen, đã có một số công trình nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu, tuy nhiên việc khảo sát hoạt tính kháng khuẩn
79
chủ yếu từ tinh dầu chiết rút ở củ nghệ đen ngoài tự nhiên. Srvidya và cs (2009) nghiên cứu cho thấy, tinh dầu của củ nghệ đen ở Ấn Độ có tác dụng ức chế một số vi khuẩn, trong đó tác dụng ức chế sinh trưởng mạnh đối với vi khuẩn B. cereus nhưng tương đối với E. coli và S. aureus [149]. Wilson và cs (2005) nghiên cứu tính kháng khuẩn của tinh dầu nghệđen tự nhiên ở Nam Ấn Độ cũng cho thấy, nó ức chế sinh trưởng nhiều loài vi sinh vật nhưng không ức chế S. aureus và E. coli [176]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, tinh dầu thu được từ tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro có khả năng ức chế sinh trưởng của cả 3 loài vi khuẩn kiểm định là S. aureus, B. cereus và E. coli.
80
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Trên cơ sở các kết quả thu được, chúng tôi rút ra những kết luận sau đây: 1. Môi trường cơ bản MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L thích hợp cho nuôi cấy callus từ bẹ lá cây nghệ đen
in vitro. Callus được tạo thành có màu có màu vàng, rắn và rời rạc được dùng làm nguyên liệu để thiết lập nuôi cấy huyền phù.tế bào.
2. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ lắc 120 vòng/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong bình tam giác 250 ml. Sinh khối đạt cực đại là 10,44 g tươi (0,66 g) sau 14 ngày khi nuôi cấy với cỡ mẫu là 3 g.
3. Môi trường cơ bản MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4-D 1,5 mg/L, tốc độ khuấy 150 vòng/phút, tốc độ sục khí 2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L. Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g khô) sau 14 ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g.
4. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào đạt cao nhất là 2,57% khối lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần tinh dầu ở củ cây nghệđen tự nhiên 1 năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế bào đạt cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin ở củ cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Đã có chuyển hóa sinh học curcuminoid trong nuôi cấy tế bào. Hàm lượng polysaccharide trong tế bào cao nhất là 6,55% khối lượng khô sau 10 ngày nuôi cấy, thấp hơn ở củ nghệ tự nhiên khoảng 1,4 lần. Có sự tích lũy các hợp chất sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy. Thành phần sesquiterpene hiện diện trong tế bào huyền phù ít hơn so với củ cây nghệ 1 năm tuổi. Trong tế bào có 3-4 peak của sesquiterpene giống như tế bào củ nghệ. Đã có chuyển hóa sinh học sesquiterpene trong nuôi cấy tế bào.
81
5. Tinh dầu tế bào cây nghệ đen có khả năng ức chế mạnh sinh trưởng của 3 chủng vi khuẩn B. cereus ATCC 11778 (đường kính vô khuẩn 31 mm),
S. aureus ATCC 6538 (22,33 mm) và E. coli ATCC 25922 (18,33 mm). Nhìn chung, khả năng kháng khuẩn của tinh dầu thu hồi từ tế bào nuôi cấy in vitro
khá cao.
ĐỀ NGHỊ
1. Nghiên cứu cải thiện khả năng tích lũy các hoạt chất sinh học trong tế bào nghệđen.
2. Nghiên cứu thành phần và hoạt tính của curcuminoid, sesquiterpenes, polysaccharides được sản xuất từ tế bào nghệđen.
82
NHỮNG CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyen Hoang Loc, Vo Chau Tuan, Doan Huu Nhat Binh, Truong Thi Bich Phuong, Tae-Geum Kim and Moon-Sik Yang (2009), “Accumulation of sesquiterpenes and polysaccharides in cells of zedoary (Curcuma zedoaria
Roscoe) cultured in a 10 L bioreactor”, Biotechnology and Bioprocess Engineering 14, pp. 619-624.
2. Võ Châu Tuấn, Nguyễn Hoàng Lộc (2010), “Sản xuất curcumin từ tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) nuôi cấy trong hệ lên men 10 L”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 8(3B), tr. 1459-1464.
3. Nguyễn Thị Phúc Lộc, Võ Châu Tuấn, Nguyễn Hoàng Lộc (2010), “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu chiết xuất từ tế bào nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) nuôi cấy trong hệ lên men 10 L”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B), pp. 1465-1471.
4. Vo Chau Tuan, Vu Duc Hoang, Nguyen Hoang Loc (2011), “Cell suspension culture of zedoary (Curcuma zedoaria Roscoe)”, VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology 27, pp. 64-70.
83
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Lê Quý Bảo (2004), “Các cấu tử dễ bay hơi của thân rễ Nga truật (Curcuma zedoaria Roscoe) trồng ở tỉnh Nghệ An và Hà Tĩnh”, Tạp chí Dược học
343, tr. 9-11.
2. Phan Minh Giang, Văn Ngọc Hưng, Phan Tống Sơn (1997), “Đóng góp vào việc nghiên cứu các sesquiterpenoid trong thân rễ nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe)”, Tạp chí Hóa học và Công nghiệp Hóa chất 4, tr. 9-11.
3. Trần Thị Việt Hoa, Trần Thị Phương Thảo, Vũ Thị Thanh Tâm (2007), ”Thành phần hóa học và tính kháng oxy hóa của nghệ đen (Curcuma zedoaria) trồng ở Việt Nam”, Tạp chí Phát triển KH&CN 10(4), tr. 37-47.
4. Vũ Văn Hợp, Vũ Xuân Phương (2003), “Các loài chứa alkaloid trong họ Cà (Solanaceae Juss.) ở Việt Nam”, Tạp chí Sinh học 25(4), tr. 27-31.
5. Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006). “Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn (Catharanthus rouse)”, Tạp chí Phát triển KH &CN 9, tr. 59-66.
6. Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai (2007), “Bước đầu nghiên cứu sự tạo dịch treo tế bào cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa Harms)”, Tạp chí phát triển KH &CN 10(7), tr. 11-16.
7. Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình Công nghệ tế bào, Nxb Đại học Huế.
8. Nguyễn Hoàng Lộc, Đoàn Hữu Nhật Bình, Phan Đức Lâm, Phan Thị Á Kim, Trương Thị Bích Phượng (2008), “Nghiên cứu khả năng tích lũy asiaticoside trong mô sẹo rau má (Centella asiatica (L.) Urban)”, Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4B), 873-881.
84
9. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, Hà Nội.
10. Lã Đình Mỡi, Lưu Đàm Cư (2002), Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam, Tập 2, Nxb. Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 245-250.
11. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Trịnh Đôn, Nguyễn Thị Thanh Hiền, Đinh Văn Khiêm, Lê Thị Xuân (2007), “Nuôi cấy tế bào và phục hồi mô sẹo từ huyền phù tế bào cây thông đỏ Himalaya (Taxus wallichiaana Zucc.)”,
Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(2), tr. 205-215.
12. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Kim Ngọc, Trần Văn Minh, NguyễnThị Phương Thảo (2009), Cơ sở công nghệ sinh học- Công nghệ sinh học tế bào, Tập 3, Nxb. Giáo dục, Hà Nội.
13. Lê Thị Hà Thanh, Đoàn Hữu Nhật Bình, Nguyễn Hoàng Lộc (2009), “Sản
xuất glycoalkaloid từ tế bào cây cà gai leo (Solanum hainanense
Hance)”, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 697-700.
14. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu và
ứng dụng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
15. Nguyễn Bích Thu, Phạm Kim Mãn (2000), “Nghiên cứu phương pháp định lượng glycoalkaloid trong cây cà gai leo (Solanum hainanense
Hance) bằng phương pháp acid màu”, Tạp chí Dược liệu 5(4), tr. 104-108.
16. Lê Thị Thủy Tiên, Bùi Trang Việt, Nguyễn Đức Lượng (2006), “Tạo mô sẹo và dịch huyền phù tế bào có khả năng snả xuất taxol từ lá và thân non cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc.”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 4(2), tr. 221-226.
85
Tiếng Anh
18. Anisuzzaman M., Sharmin A., Mondal S.C., Sultana R., Khalekuzzâmn M., Alam I., Alam M.F. (2008), “In vitro microrhizome in Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe-a conservation prioritized medicinal plant”,
Biological Sciences 8(7), pp. 1216-1220.
19. Arnason J.T., Mata R., Romeo J.T. (1995), Phytochemistry of medicinal plants, Plenum Press, New York.
20. Aslam J., Mujib A., Nasim S.A., Sharma M.P. (2009), “Screening of vincristine yield in ex vitro and in vitro somatic embryos derived plantlets of Catharanthus roseus L. (G) Don.”, Sci Hort 119, pp. 325- 329.
21. Bharalee R., Das A., Kalita M.C. (2005), In vitro clonal propagation of
Curcuma caesia Roxb and Curcuma zedoaria Rosc. from rhizome bud explants”, Journal of Plant Biochemistry and Biotechnology 14, pp. 61-63.
22. Bouque V., Bourgaud F., Nguyen C., Guckert A. (1998), “Production of daidzein by callus cultures of Psoralea species and comparison with plants”, Plant Cell Tissue and Organ Culture 53, pp. 35-40.
23. Bourgaud F., Gravot A., Milesi S., Gontier E. (2001), “Production of plant secondary metabolites: a historical perspective”, Plant Science 161, pp. 839-851.
24. Bu’lok J., Kristiansen B. (1987), Basic Biotechnology, Academic Press, London, pp. 525-544.
25. Bugno1 A., Nicoletti M.A., Almodóvar A.A.B., Pereira T.C., Auricchio M.T. (2007), “Antimicrobial efficacy of Curcuma zedoaria extract as assessed by regression compared with comercial mouthrinses mouthrises”, Brazilian Journal of Microbiology 38, pp. 440-445.
86
26. Canter P.H., Thomas H., Ernst E. (2005), “Bringing medicinal plants into cultivation: opportunities and challenges for biotechnology”, Trends Biotechnol 23, pp. 180-185.
27. Carvalho F.R., Vassão R.C., Nicoletti M.A., Maria D.A. (2010), “Effect of
Curcuma zedoaria crude extract against tumor progression and immunomodulation”, Venom Anim Toxins incl Trop Dis 16, pp. 324-341.
28. Champakaew D., Choochote W., Pongpaibul Y., Chaithong U., Jitpakdi A., Tuetun B., Pitasawat B. (2007), “Larvicidal efficacy and biological stability of a botanical natural product, zedoary oilimpregnated sand granules, against Aedes aegypti”, Parasitol Res 100, pp. 729-737.
29. Chan L.K., Thong W.H. (2004), “In vitro propagation of Zingiberaceae species with medicinal properties”, plant Biotechnol 6, pp. 181-188.
30. Chaplin M.F., Kennedy J.F. (1994), Carbohydrate analysis. A practical approach, 2nd ed., Oxford University Press, Oxford, UK., pp. 143-204.
31. Chattopadhyay S., Farkya S., Srivastava A.K., Bisaria V.S. (2002), “Bioprocess considerations for production of secondary metabolites by plant cell suspension cultures”, Biotechnol Bioprocess Eng 7, pp. 138-149.
32. Chena W., Lua Y., Gao M., Wua J., Wanga A., Shic R. (2010), “Antiangiogenesis effect of essential oil from Curcuma zedoaria in vitro and in vivo”, Ethnopharmacology Doi:10.1016/j.jep.2010.09.031.
33. Choi D.S., Andrade M.H.C., Willis L.B., Cho C., Schoenheit J., Boccazzi P., Sambanthamurthi R., Sinskey A.J., Rha C. (2008), “Effect of agitation and aeration on yield optimization of oil palm suspension culture”, Journal of Oil palm Research Special Issue on Malaysia-MIT Biotechnology Partnership Programme, 1, pp. 23-34.
34. Christen A.A., Bland J., Gibson G.M. (1989), “Cell cultures as a means to produce taxol”, Proc Am Assoc Cancer Res 30, pp. 566.
87
35. Davey M.R., Anthony P. (2010), Plant Cell Culture, John Wiley & Sons, Ltd.
36. Duke J.A. (2003), CRC Handbook of Medicinal Spices, CRC Press, Boca Raton, USA.
37. Eibl R., Werner S., Eibl D. (2009), “Bag bioreactor based on wave induced motion: characteristics and applications” Adv Biochem Eng Biotechno
115, pp. 55-87.
38. Eibl R., Eibl D. (2002), “Bioreactors for plant cell and tissue cultures”, In: Oksman-Caldentey K-M, Barz W (eds) Plant biotechnology and transgenic plants, Marcel Dekker, New York, pp 165-199.
39. Eibl R., Eibl D. (2006), In Plant Tissue Culture Engineering. Focus on Biotechnology, vol 6, Springer Berlin-Heidelberg-New York, pp. 203-227.
40. Eibl R., Eibl D. (2008), “Design of bioreactors suitable for plant cell and tissue culture”, Phytochem Rev 7, pp. 593-598.
41. Fett-Neto A.G., Pennington J.J., DiCosmo F. (1995), “Effect of white light on taxol and baccatin III accumulation in cell cultures of Taxus cuspidata Sieb and Zucc.”, Plant Physiol 146, pp. 584-590.
42. Fett-Neto A.G., Zhang W.Y., DiCosmo F. (1994), “Kinetics of taxol production, growth and nutrient uptake in cell suspensions of Taxus cuspidate”, Biotechnology and Bioengineering 44, pp 205-210.
43. Ficker C.E., Smith M.L., Susiarti S., Leaman D.J., Irawati C., Arnason J.T. (2003), “Inhibition of human pathogenic fungi by members of Zingiberaceae used by the Kenyah (Indonesian Borneo)”,
Ethnopharmacol 85, pp. 289-293.
44. Fulzele D.P. (2000), Bioreactor technology for large scale cultivation of plant cell suspension cultures and production of bioactive compounds, BARC Newsletter.
88
45. Furuya T. (1988), Saponins (ginseng saponins). Cell cultures and somatie cell genetics of plants, vol 5, Academic Press, San Diego, CA, pp. 213-234.
46. Garg S.N., Naquvi A.A., Bansal R.P., Bahl J.R., Kumar S. (2005), “Chemical composition of the essential oil from the leaves of Curcuma zedoaria Rosc. of Indian origin”, Essent Oil Res 17, pp. 29-31.
47. Gautam P.L., Raina R., Srivastava U., Raychaudhuri S.P., Singh B.B. (1998), Prospects of medicinal plants, Indian Society of Plant Genetic Resources, NBPGR, New Delhi.
48. Georgiev M.I., Weber J., Maciuk A. (2009), “Bioprocessing of plant cell cultures for mass production of targeted compounds”, Appl Microbiol Biotechnol 83, pp. 809-823.
49. Gou Y., Zhang Z. (2005), “Establishment and plant regeneration of somatic embryogenic cell suspension cultures of Zingiber officinale Rosc.”,
Scientia Horticulturae, 107, pp. 90-96.
50. Gunter E. A., Ovodo Y. S. (2003), “Production of polysaccharides by Silene vugaris callus culture depending on carbohydrate of the medium”,
Nauka Interperiodica 68(6), pp. 882-889.
51. Guirib-Fakim A. (2006), “Medicinal plants: Tradition of yesterday and drugs of tomorrow”, Mol Aspects Med 27(1), pp. 1-93.
52. Gupta S.D., Ibaraki Y. (2006), Plant Tissue Culture Engineering, Springer, Printed in the Netherlands.
53. Haas C., Weber J., Ludwig-Mueller J., Deponte S., Bley T., Georgiev M. (2008), “Flow cytometry and phytochemical analysis of a sunflower cell suspension culture in a 5-L bioreactor”, Z Naturforsch 63, pp. 699-705.
54. Halina S.L., Leslaw P. (2003), “The effect of carbohydrate source on the development of Brassica napus L. immature embryos in vitro”, ACTA Biologica Cracoviensia Series Botanica 45(2), pp. 83-190.
89
55. Hanif R., Qiao L., Shiff S.J., Rigas B, (1997), “Curcumin, a natural plant phenolic food additive, inhibits cell proliferation and induces cell cycle changes in colon adenocarcinoma cell lines by a prostaglandin- independent pathway”, Lab Clin Med 130(6), pp. 576-584.
