3.2.1. Ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy
Sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy trên môi trường MS có 2% sucrose, bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,5 mg/L được dùng làm nguyên liệu để khảo sát. Tế bào với các cỡ mẫu ban đầu khác nhau (2, 3, 4, 5 g tế bào) được nuôi cấy trên môi trường lỏng có thành phần giống như môi trường sinh trưởng tốt nhất của callus, ở tốc độ lắc 100 vòng/phút. Kết quả ảnh hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy lên sinh trưởng của tế bào trong khoảng thời gian từ 2 đến 18 ngày được trình bày ở bảng 3.3.
Kết quả cho thấy, với cỡ mẫu 2 g, sinh khối đạt cao nhất sau 16 ngày là 4,12 g tươi (0,37 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,06. Với 3 g tế bào nuôi cấy thì sinh trưởng của tế bào đạt cực đại chỉ sau 14 ngày là 5,61 g tươi (0,41 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 1,87. Khi tăng cỡ mẫu lên 4-5 g, sinh khối đạt cực đại sau 12 ngày, tương ứng là 6,12 g tươi (0,46 g khô) và 7,22 g tươi (0,51 g khô) nhưng chỉ số sinh trưởng thấp chỉđạt 1,54 và 1,44.
48
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù
trong bình tam giác
2 g tế bào 3 g tế bào 4 g tế bào 5 g tế bào TN FW DW GI FW DW GI FW DW GI FW DW GI 2 2,22c 0,18d 1,11 3,14d 0,28c 1,05 4,07c 0,32b 1,02 5,20d 0,39c 1,04 4 2,52c 0,24c 1,26 3,52c 0,32c 1,17 4,34c 0,35b 1,09 5,32d 0,42c 1,06 6 3,00b 0,24c 1,50 4,00c 0,35b 1,33 4,94c 0,37b 1,24 5,61c 0,44c 1,12 8 3,30b 0,30b 1,65 4,53b 0,38b 1,51 5,65b 0,40b 1,41 6,09c 0,47b 1,22 10 3,50b 0,33b 1,75 4,92b 0,40a 1,64 6,04a 0,42b 1,51 7,02b 0,48b 1,40 12 3,70a 0,35b 1,85 5,15b 0,40a 1,72 6,15a 0,44a 1,54 7,22a 0,51a 1,44 14 4,00a 0,35b 2,00 5,61a 0,41a 1,87 6,12a 0,46a 1,53 5,68c 0,41c 1,14 16 4,12a 0,37a 2,06 5,21b 0,37b 1,74 5,20b 0,35b 1,30 5,00d 0,32cd 1,00 18 4,01a 0.23c 2,01 4,67b 0,29c 1,56 4,56c 0,27c 1,14 4,12e 0,22d 0,82
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05
TN: thời gian nuôi cấy (ngày); FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI:
chỉ số sinh trưởng
Nghiên cứu cũng cho thấy, mặc dù với cỡ mẫu nuôi cấy là 2 g, sau 14 ngày chỉ số sinh trưởng của tế bào có cao (2,0), nhưng chất lượng dịch huyền phù tế bào kém hơn (dịch tế bào có màu vàng nhạt, ít đồng nhất) so với khi sử dụng 3 g tế bào nuôi cấy (dịch huyền phù tế bào có màu vàng đậm, tươi và đồng nhất). Vì thế, theo nhận định của chúng tôi, sử dụng 3 g tế bào callus nuôi cấy trong bình tam giác có thể tích 250 ml chứa 50 ml môi trường là thích hợp hơn cả.
Nói chung, xác định cỡ mẫu là rất cần thiết để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng diễn ra hiệu quả. Khi mật độ tế bào trong bình nuôi cấy quá cao hoặc quá thấp đều làm cho tế bào sinh trưởng kém [111]. Mật độ ban đầu thấp có thể dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng hàm mũ; trong khi đó, nếu mật độ tế bào ban đầu cao hơn có thể nhanh chóng dẫn đến pha tử vong (Ling và cs 2008) [84]. Ảnh
49
hưởng của cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù đã được khảo sát trên nhiều loài thực vật khác nhau. Gou và Zhang (2005), khi nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào cây gừng nhận thấy, nếu lượng mẫu ban đầu thấp hơn 0,5% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng chậm, trong khi với lượng mẫu cao hơn 2,0% (w/v) thì tế bào sẽ sinh trưởng nhanh [49]. Ling và cs (2008) nuôi cấy tế bào cây Ficus deltoidea với cỡ mẫu là 2,5-10 ml dịch tế bào huyền phù, kết quả tế bào sinh truởng tốt nhất ở 10 ml và sinh khối đạt cực đại sau 12 ngày. Nếu lượng mẫu thấp hơn 2,5 ml thì pha thích nghi (pha lag) của tế bào sẽ kéo dài đến hết ngày thứ 9 [84]. Nagella và Murthy (2010) cũng đã khảo sát ảnh hưởng của cỡ mẫu ban đầu từ 2,5- 20 g/L lên tích lũy sinh khối của tế bào cây Withania somnifera nhận thấy, nuôi cấy với lượng mẫu khoảng 10 g/L là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào [109].
Từ kết quả khảo sát ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen cho thấy, tế bào nghệđen sinh trưởng tốt với cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu là 3 g trong bình tam giác thể tích 250 ml, chứa 50 ml môi trường và sau 14 ngày sinh khối sẽ đạt cực đại. Trong các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi sử dụng cỡ mẫu nuôi cấy là 3 g và thu hoạch sinh khối sau 14 ngày nuôi cấy để khảo sát ảnh hưởng các điều kiện nuôi cấy khác lên sinh trưởng của tế bào nghệđen.
3.2.2. Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Tế bào được nuôi cấy trên môi trường MS có BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,5 mg/L, sucrose 20 g/L, cỡ mẫu ban đầu là 3 g với tốc độ lắc thay đổi từ 80 đến 180 vòng/phút. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.4.
Nhìn chung, tốc độ lắc đã ảnh hưởng lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen. Với tốc độ lắc tăng từ 80 đến 120 vòng/phút, sinh khối tế bào đã tăng dần lên và đạt cực đại là 5,91 g tươi (0,44 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,97 và dịch huyền phù tế bào có màu vàng sáng, đồng nhất. Khi tăng tốc độ lắc lên cao hơn (150-180 vòng/phút), tế bào sinh trưởng chậm lại, đặc biệt bị ức chế
50
mạnh ở tốc độ lắc 180 vòng/phút, sinh khối cao nhất chỉ là 4,75 g tươi (0,35 g khô), dịch huyền phù tế bào chuyển sang màu nâu sau 14 ngày nuôi cấy.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tốc độ lắc lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền
phù trong bình tam giác
Tốc độ lắc (vòng/phút) FW DW GI 80 5,00ab 0,34c 1,67 100 5,61b 0,41b 1,87 120 5,91a 0,44a 1,97 150 5,60b 0,42b 1,87 180 4,75ab 0,35c 1,58
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng
Tốc độ lắc ảnh hưởng nhiều đến sinh trưởng tế bào do liên quan đến việc cung cấp oxy và chất dinh dưỡng. Lượng oxygen trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng quá trình trao đổi chất của tế bào thực vật. Lượng oxy này chủ yếu phụ thuộc vào lớp không khí trên bề mặt môi trường. Môi trường lỏng được trộn đều sẽ tăng tốc độ hòa tan của oxy, đồng thời tạo điều kiện dễ dàng cho tế bào hấp thụ chất dinh dưỡng. Vì vậy, tốc độ sinh trưởng của tế bào sẽ tăng khi tăng tốc độ lắc đến một giới hạn thích hợp, tuy nhiên khi tốc độ lắc quá cao sẽức chế sinh trưởng do tế bào bị biến dạng gây nên hiện tượng tự phân làm chết tế bào (Narayanaswany 1994) [111], (Ziv 2000) [193]. Theo nghiên cứu của Choi và cs (2008), tốc độ lắc thích hợp cho nuôi cấy huyền phù tế bào cây cọ dầu nằm trong khoảng từ 120-300 vòng/phút. Nếu tốc độ lắc thấp hoặc cao hơn (80 và 335 vòng/phút) đều bất lợi cho sinh trưởng của tế bào [33]. Nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy, sinh trưởng của tế bào nghệ nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml cũng chịu ảnh hưởng đáng kể khi thay đổi tốc độ lắc, tế bào sinh trưởng tốt nhất khi nuôi cấy trên máy lắc ở tốc độ 120 vòng/phút.
51
3.2.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST
Khảo sát ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen bằng cách nuôi 3 g tế bào trên môi trường MS có 20 g/L sucrose, bổ sung các chất 2,4-D và BA ở các nồng độ khác nhau, tốc độ lắc ở 120 vòng/phút.
3.2.3.1. Ảnh hưởng của BA
Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ sung BA từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.5. Kết quả nghiên cứu cho thấy, môi trường có bổ sung BA 0,25 mg/L và 0,5 mg/L có hiệu quả tương đương (p<0,05) trong kích thích sinh trưởng của tế bào, khối lượng tươi của tế bào đạt từ 2,06-2,08 g (0,45-0,46 g khô) và chỉ số sinh trưởng xấp xỉ 2,1 là cao nhất. Trên các môi trường có nồng độ BA cao hơn (1,0 -2,5 mg/L), sinh trưởng của tế bào giảm nhanh và bị ức chế mạnh ở nồng độ BA 2,5 mg/L, sinh khối tế bào chỉ đạt 4,55 g tươi (0,32 g khô), chỉ số sinh trưởng là 1,52 sau 14 ngày nuôi cấy.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù
trong bình tam giác
BA (mg/L) FW DW GI 0,25 6,17a 0,45a 2,06 0,5 6,25a 0,46a 2,08 1,0 5,76b 0,42ab 1,92 1,5 5,92b 0,37b 1,97 2,0 5,41bc 0,35b 1,80 2,5 4,55bc 0,32b 1,52
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
52
3.2.3.2. Ảnh hưởng của 2,4-D
Khả năng sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong môi trường có bổ sung 2,4-D từ 0,25-2,5 mg/L sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.6. Kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ 2,4-D 1,5 mg/L có ảnh hưởng tốt nhất lên sinh trưởng của tế bào, khối lượng tươi của tế bào đạt 6,75 g (0,52 g khô) và chỉ số sinh trưởng là 2,25, cao hơn các môi trường còn lại.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của 2,4-D lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù
trong bình tam giác
2,4 D (mg/L) FW DW GI 0,25 5,10c 0,42b 1,70 0,5 5,77b 0,43b 1,92 1,0 6,02b 0,45b 2,01 1,5 6,75a 0,52a 2,25 2,0 6,04b 0,46b 2,01 2,5 5,35c 0,36c 1,78
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng
3.2.3.3. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA
Tế bào nghệ đen được nuôi cấy trên các môi trường có bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L và BA 0,25-2,5 mg/L; BA 0,5 mg/L và 2,4-D 0,25-2,5 mg/L. Kết quả sinh trưởng của tế bào sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.7.
53
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền
phù trong bình tam giác
2,4 D (mg/L) BA (mg/L) FW DW GI 0,5 0,25 5,82b 0,43b 1,94 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 0,5 1,0 5,32c 0,40c 1,77 0,5 1,5 5,00c 0,39c 1,67 0,5 2,0 4,45cd 0,38c 1,48 0,5 2,5 4,00d 0,35c 1,33 0,25 0,5 5,12c 0,39c 1,71 0,5 0,5 5,91b 0,44b 1,97 1,0 0,5 6,20b 0,46b 2,07 1,5 0,5 7,22a 0,55a 2,41 2,0 0,5 6,03b 0,43b 2,01 2,5 0,5 6,01b 0,42b 2,00
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng
Nhìn chung, sinh trưởng của tế bào trên các môi trường có bổ sung đồng thời 2,4-D và BA cho kết quả tốt hơn các môi trường chỉ bổ sung riêng rẽ hai chất này. Khối lượng tế bào và chỉ số sinh trưởng đạt cao nhất trong môi trường có 2,4-D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L, tương ứng là 7,22 g tươi (0,55 g khô) và 2,41. Ở môi trường này dịch tế bào huyền phù có màu vàng sáng và đồng nhất. Những môi trường còn lại không thích hợp lắm cho sinh trưởng của tế bào, hầu hết dịch tế bào huyền phù ngã sang màu nâu và một số tế bào bị chết sau 14 ngày nuôi cấy.
Tóm lại, sau khi khảo sát trên nhiều môi trường có bổ sung chất ĐHST ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi nhận thấy môi trường MS có bổ sung 2,4- D 1,5 mg/L và BA 0,5 mg/L là môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ đen thích hợp nhất, sinh khối tế bào cao nhất là 7,22 g tươi (0,55 g khô), gấp khoảng 2,5 lần so với sinh khối tế bào đưa vào ban đầu sau 14 ngày nuôi cấy.
54
Kittipongpatana và cs (1998) khi nghiên cứu nuôi cấy tế bào huyền phù cây Solanum aviculare nhận thấy rằng tế bào sinh trưởng tốt nhất trên môi trường lỏng MS bổ sung 4,52 M 2,4-D và 4,44 M BAP, chỉ số sinh trưởng tươi và khô cao nhất tương ứng là 10,38 và 4,43.
3.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon
Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen, chúng tôi nuôi cấy 3 g tế bào (10 ngày tuổi) trong môi trường MS có bổ sung 2,4-D 1,5 mg/L, BA 0,5 mg/L với các nồng độ khác nhau của sucrose, glucose và fructose từ 20 đến 70 g/L , tốc độ lắc 120 vòng/phút.
3.2.4.1. Ảnh hưởng của sucrose
Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của sucrose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù
trong bình tam giác
Sucrose (g/L) FW DW GI 20 7,22c 0,55b 2,41 30 10,44a 0,66a 3,48 40 8,85b 0,64a 2,95 50 8,80b 0,65a 2,93 60 8,75b 0,70a 2,92 70 6,75c 0,60b 2,25
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
FW: khối lượng tươi (g); DW: khối lượng khô (g), GI: chỉ số sinh trưởng
Kết quả nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ sucrose thấp (20 g/L) tế bào sinh trưởng chậm, chỉđạt 7,22 g khối lượng tươi (0,55 g khô). Sinh trưởng của tế bào đã tăng mạnh đạt 10,44 g khối lượng tươi (0,66 g khô) với chỉ số sinh trưởng là 3,48 trong môi trường có bổ sung sucrose 30 g/L, dịch huyền phù có màu vàng
55
tươi và khá đồng nhất (Hình 3.3). Ở nồng độ sucrose 40-70 g/L, sinh trưởng của tế bào giảm, đặc biệt là ở 70 g/L (chỉđạt 6,75 g tươi/0,60 g khô).
Sucrose được xem là nguồn carbon thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào thực vật, nồng độ thường dùng khoảng từ 20 đến 30 g/L (Suzuki và cs 1984). Sucrose vừa là nguồn cung cấp năng lượng vừa là một thành phần nguyên liệu trong sinh tổng hợp các chất thứ cấp. Tốc độ tăng trưởng sinh khối của tế bào luôn luôn liên quan trực tiếp với sự tiêu thụ sucrose (Rao và Ravishankar 2002) [132]. Theo Omar và cs (2004) trên môi trường mà tất cả các nguồn dinh dưỡng ở mức dư thừa, sự gia tăng nồng độ sucrose sẽ dẫn đến tăng sinh khối khô [114]. Một số nghiên cứu khác như nuôi cấy tế bào cây Solanum eleagnifolium
(Nigra và cs 1990), tế bào cây Solanum chrysotrichum (Villarreal và cs 1997) [168], tế bào cây Psoralea corylifolia (Shinde và cs 2009) cũng nhận thấy tế bào tăng sinh khối khô cùng với việc tăng nồng độ sucrose. Tuy nhiên, khi nồng độ sucrose quá cao sẽ dẫn đến áp suất thẩm thấu vượt giới hạn cho phép của tế bào, vì thếảnh hưởng xấu lên sinh trưởng của chúng (Bùi Văn Lệ và cs 2006) [5].
Hình 3.3. Dịch huyền phù của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy trong bình
tam giác trên môi trường có 3% sucrose
Trong nghiên cứu của chúng tôi nồng độ sucrose 30 g/L là thích hợp nhất cho sinh trưởng của tế bào nghệđen. Kết quả này cũng tương tự với kết quả nuôi cấy tế bào cây sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha Grushv.) (Thanh và cs 2007) [157], cây nhân sâm (Panax ginseng) (Lian và cs 2002), cây Gynema
56
sylvestre (Lee và cs 2006) [78], và cây Withania somnifera (Nagella và Murthy 2010) [109].
3.2.4.2. Ảnh hưởng của glucose
Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau 14 ngày nuôi cấy được trình bày ở bảng 3.9. Kết quả cho thấy, tế bào sinh trưởng tương đối thấp khi được nuôi trong môi trường có glucose 20-30 g/L. Ở nồng độ glucose từ 40-60 g/L, sinh trưởng của tế bào tăng lên và sinh khối đạt cực đại là 7,32 g tươi (0,59 g khô), chỉ số sinh trưởng là 2,44. Glucose ở nồng độ 70 g/L đã ức chế sinh trưởng của tế bào.
Một số kết quả nghiên cứu cho thấy, bên cạnh đường sucrose, glucose cũng là nguồn carbon thích hợp thường được sử dụng trong nuôi cấy mô và tế bào của nhiều loài thực vật (Kato và cs 2007, Sturn và cs 1999, Koch 2004). Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi, glucose không phải là nguồn carbon thích hợp cho sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen, kết quả này cũng tương tự như nuôi cấy tế bào cây Ficus deltoidea (Ling và cs 2008) [84] và cây Psoralea corylifolia (Shinde và cs 2009).
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của glucose lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù
trong bình tam giác
Glucose (g/L) FW DW GI 20 3,15cd 0,22c 1,05 30 6,05c 0,42bc 2,02 40 7,12a 0,53b 2,37 50 7,20a 0,55b 2,40 60 7,32a 0,59a 2,44 70 6,65b 0,53b 2,22
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở