Callus thường được dùng làm nguồn nguyên liệu khởi đầu để thiết lập nuôi cấy huyền phù tế bào của thực vật. Vì vậy, tìm ra môi trường dinh dưỡng thích hợp cho nuôi cấy callus là rất cần thiết. Bảng 3.1 trình bày kết quả tạo callus từ bẹ lá của cây nghệ đen in vitro trên các môi trường khác nhau sau 90 ngày nuôi.
Bảng 3.1.Khả năng tạo callus từ bẹ lá của cây nghệđen in vitro
2,4-D (mg/L) BA (mg/L) % mẫu vật tạo callus Sinh trưởng
của callus Hình thái callus
- - - - - 0,5 0,5 15,74c ++ Trắng, mọng nước 1,0 1,0 46,01a ++++ Trắng, xốp 2,0 2,0 40,10b ++++ Trắng, xốp 3,0 3,0 10,20d +++ Trắng, mọng nước 4,0 4,0 8,20cd + Trắng, mọng nước
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ởp<0,05
(Duncan’s test).
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh trưởng
kém; - : không xuất hiện callus.
Các môi trường có bổ sung BA và 2,4-D đều kích thích tạo callus, trong khi đó môi trường không bổ sung chất ĐHST lại không tạo callus. Môi trường có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA
45
là thích hợp nhất (tỷ lệ tạo callus từ 40,1-46,01%), callus có màu trắng, xốp và có khả năng sinh trưởng tốt (Hình 3.1A). Ở các môi trường còn lại tỷ lệ tạo callus thấp (8,2-15,74%), callus có màu trắng và mọng nước (Hình 3.1B).
Hình 3.1. Callus hình thành từ bẹ lá của cây nghệđen in vitro. (A) callus trắng và
xốp, (B) callus trắng và mọng nước.
Mello và cs (2001b) đã tạo được callus nghệ đen từ đoạn rễ trên môi trường MS có 3% sucrose, bổ sung 13,4 µM NAA và 2,2 µM BA, nuôi trong điều kiện tối. Nghiên cứu của Miachir và cs (2004) cho thấy, callus nghệ đen hình thành từ đoạn rễ sinh trưởng trên môi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L NAA, nhưng nếu nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 2,4 D trong điều kiện tối thì callus sẽ không xuất hiện [102].
Trong nghiên cứu của chúng tôi, các ĐHST như NAA và KIN cũng đã được thăm dò khi nuôi cấy bẹ lá, tuy nhiên chúng cho kết quả rất kém, callus sinh trưởng yếu trên môi trường có NAA và hóa nâu trên môi trường có KIN. Chúng tôi cũng đã khảo sát khả năng hình thành callus từ đoạn rễ trên các môi trường có bổ sung 2,4-D, BA, KIN, và NAA. Trên hầu hết các môi trường thí nghiệm, mô rễ tạo callus rất kém hoặc callus có màu trắng, mọng nước và hơi nhầy, sinh trưởng rất chậm.
Trong việc chọn dòng tế bào callus để thiết lập nuôi cấy huyền phù, các dòng callus rắn và dễ vỡ vụn (friable) thường được lựa chọn làm nguyên liệu
B A
46
nuôi cấy huyền phù tế bào do chúng có khả năng sinh trưởng nhanh và ổn định trong môi trường lỏng [165]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, callus điều có khả năng sinh trưởng mạnh trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 1,0 mg/L BA hoặc 2,0 mg/L 2,4-D và 2,0 mg/L BA. Tuy nhiên, các callus này có dạng xốp và khó vở vụn nên không thích hợp để làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào. Vì thế, cần phải chọn các dòng tế bào callus thích hợp hơn để thiết kế nuôi cấy huyền phù.
Callus sơ cấp có màu trắng, xốp và sinh trưởng mạnh được cấy chuyển lên môi trường MS có bổ sung 2,4-D và BA từ 0,25-4 mg/L. Kết quả cho thấy, các callus sinh trưởng trên môi trường có 2 mg/L 2,4-D và 2 mg/L BA dần dần hóa nâu và chết sau khi cấy chuyển. Các callus trên môi trường có 1 mg/L 2,4-D và 1 mg/L BA phát triển thành dạng callus thứ cấp có khả năng sinh trưởng tốt nhất trên môi trường có chứa 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA (Bảng 3.2). Các môi trường còn lại không có tác dụng kích thích sinh trưởng callus (callus sinh trưởng kém hoặc hóa nâu và chết) sau 4 tuần cấy chuyển.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST lên sinh trưởng và phát sinh hình thái của
callus 2,4-D (mg/L) BA (mg/L) Sinh trưởng
của callus Hình thái callus
0,25 0,25 + Trắng và mọng nước
0,50 0,50 ++++ Vàng sáng, rắn và rời rạc
1,00 1,00 ++ Trắng và xốp
2,00 2,00 ++ Trắng và mọng nước
4,00 4,00 - Hóa nâu và chết
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
++++: sinh trưởng mạnh; +++: sinh trưởng khá; ++: sinh trưởng trung bình; +: sinh
47
Hình 3.2. Callus có màu vàng, rắn và rời rạc sau 14 ngày nuôi cấy
Các calus thứ cấp có màu vàng sáng, rắn và dễ vỡ vụn (Hình 3.2) thu được trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA sau 4 tuần được cấy chuyển 2 tuần một lần lên môi trường có thành phần tương tự để nhân sinh khối callus, tạo nguyên liệu cho nuôi cấy huyền phù tế bào trong bình tam giác.