3.3.1. Khảo sát sinh trưởng của tế bào
Sinh khối tế bào (10 ngày tuổi) nuôi cấy lắc trên bình tam giác 250 ml trong môi trường cơ bản MS có 3% sucrose, bổ sung thêm BA 0,5 mg/L và 2,4- D 1,5 mg/L được sử dụng làm nguyên liệu để khảo sát quá trình sinh trưởng của tế bào nghệ đen khi nuôi cấy hệ lên men thể tích 14 L, thể tích làm việc 10 L (Hình 3.6).
60
Hình 3.6. Nuôi cấy tế bào nghệđen trong hệ lên men 10 L
Kết quả nghiên cứu trình bày ở hình 3.7 cho thấy, sinh khối tế bào đạt cực đại ở ngày thứ 14 với 241,67 g tươi (22,28 g khô), sau đó bắt đầu giảm dần. Sinh khối tươi tế bào chỉ còn lại 132,67 g (10,08 g khô) sau 18 ngày nuôi cấy. Lúc này, quan sát thấy dịch huyền phù tế bào từ màu vàng chuyển sang nâu, nguyên nhân có thể liên quan đến sự xuất hiện các sản phẩm phenol trong môi trường do quá trình chuyển hóa trao đổi chất của tế bào tạo ra.
0 5 10 15 20 25 0 50 100 150 200 250 300 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Kh ố i l ượ ng k hô t ế bà o (g ) Kh ố i l ượ ng t ươ i t ế bà o (g )
Thời gian nuôi cấy (ngày)
Khối lượng tươi tế bào Khối lượng khô tế bào
Hình 3.7. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hệ lên men nuôi cấy trên môi
trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 120 vòng/phút;
61
Như vậy, thời gian và động thái sinh trưởng của tế bào cây nghệ đen nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L tương tự nuôi cấy trong bình tam giác 250 ml (Hình 3.4). Thời gian sinh trưởng cực đại của tế bào nghệ đen trong hệ lên men là 14 ngày, kết quả này cũng tương đương với sinh trưởng của tế bào cây Gymnema sylvestre (15 ngày) (Lee và cs 2006) [78] và
Solanum chrysotrichum (16 ngày) (Rodríguez-Monroy và cs 2004) [134] khi nuôi cấy trong hệ lên men.
Hình 3.8. Sinh khối tươi (A) và sinh khối khô (B) của tế bào nghệđen sau 14 ngày
nuôi cấy trong hệ lên men
Dựa trên kết quả khảo sát đường cong sinh trưởng của tế bào nghệ đen, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy trong hệ lên men (cỡ mẫu, tốc độ khuấy, tốc độ sục khí) lên sinh trưởng của tế bào sau 14 ngày.
3.3.2. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy
3.3.2.1. Cỡ mẫu
Lượng mẫu đưa vào nuôi cấy trong hệ lên men là một trong những yếu tố quan trọng có thể ảnh hưởng đến sự tích lũy sinh khối và các sản phẩm trao đổi chất. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, cỡ mẫu nuôi cấy ban đầu đã ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sinh trưởng của tế bào. Sau 14 ngày nuôi cấy, khả năng tích lũy sinh khối của tế bào tăng lên cùng với sự
62
tăng lượng mẫu nuôi cấy từ 100 đến 200 g tế bào và đạt cực đại là 514,64 g tươi (47,97 g khô). Tuy nhiên, khi tăng lượng mẫu lên 250 g thì sinh trưởng của tế bào bị ức chế do tăng mật độ tế bào, vì thế chỉ đạt 441 g tươi (38,89 g khô) (Bảng 3.11).
Bảng 3.11.Ảnh hưởng của cỡ mẫu lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L
Cỡ mẫu (g) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
100 241,67c 22,28d
150 358,33bc 32,68c
200 514,67a 47,97a
250 441,00b 38,89b
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở p<0,05 (Duncan’s test).
Lee và cs (2006) khi nuôi cấy huyền phù tế bào cây Gymnema sylvestre
cho thấy, cỡ mẫu ban đầu khoảng 60 g/L thích hợp cho sinh trưởng tế bào và tốc độ sinh trưởng sẽ giảm nếu đưa vào nuôi cấy 80 hoặc 100 g/L [78]. Matsubara và cs (1989) nghiên cứu ở cây Coptis japonica nhận thấy lượng tế bào nuôi cấy ban đầu 8 g/L thích hợp cho sự tích lũy sinh khối [97].
3.3.2.2. Tốc độ khuấy
Khuấy trộn có tác dụng làm tăng tốc độ hòa tan của oxy và các chất dinh dưỡng trong môi trường giúp tế bào sinh trưởng tốt hơn. Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, khi tăng tốc độ khuấy từ 100 đến 150 vòng/phút thì sinh khối tế bào cũng tăng theo và cực đại đạt là 561 g tươi (50,84 g khô). Tuy nhiên, khi khuấy trộn trên 150 vòng/phút thì sinh trưởng tế bào bắt đầu giảm và chỉđạt được 437 g tươi (37,42 g khô) ở 200 vòng/phút (Bảng 3.12).
63
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tốc độ khuấy lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L
Tốc độ khuấy
(vòng/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
100 435,67c 38,19c
120 514,67bc 47,97b
150 561,00a 50,84a
180 547,33b 50,03a
200 437,00c 37,42c
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
Paek và cs (2005) cho rằng, trong quá trình nuôi cấy huyền phù, thủy lực sinh ra do khuấy trộn cần phải nhỏ để không gây nguy hại cho mô hay tế bào nhưng phải đủ lớn để kích thích các chức năng của chúng [116]. Nguyên nhân của sự ức chế sinh trưởng tế bào khi nuôi ở tốc độ khuấy cao có thể là do các tế bào bị phá vỡ cơ học và gây ra hiện tượng tự phân làm chết tế bào (Ziv, 2000) [193]. Wang và cs (2010) khi nuôi cấy tế bào cây Glycyrrhiza inflata trong hệ lên men đã nhận thấy sinh khối tế bào đạt cao nhất ở 150 vòng/phút; ở tốc độ khuấy 100 và 300 vòng/phút, khả năng sinh trưởng của tế bào kém hơn [171]. Nghiên cứu của Choi và cs (2008) cho thấy, tốc độ khuấy 120 và 225 vòng/phút đã tăng sinh khối tế bào của cây cọ dầu lên đến 200%, nhưng khi khuấy với tốc độ 335 vòng/phút thì sinh khối tế bào chỉ tăng 7% [33].
3.3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí
Kết quả của chúng tôi cho thấy, tốc độ sục khí cũng ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng tế bào nghệđen. Ở tốc độ sục khí 1,5-2,5 L/phút, sinh trưởng của tế bào tăng dần và đạt cực đại với 603 g tươi (53,25 g khô). Nếu tốc độ sục khí tiếp tục tăng lên từ 3-3,5 L/phút thì sinh trưởng của tế bào sẽ giảm. Ở tốc độ sục khí 3,5 L/phút, khối lượng tươi của tế bào chỉđạt 441 g (33,17 g khô) (Hình 3.9 và Bảng 3.13).
Hàm lượng oxy hòa tan tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của tế bào nuôi cấy, khi tốc độ sục khí tăng, tốc độ hòa tan của oxy sẽ
64
tăng. Tuy nhiên, sinh trưởng của tế bào không phải luôn luôn tỷ lệ thuận với tốc độ sục khí mà nó bị giới hạn trong một mức độ nhất định. Việc sục khí và khuấy trộn không chỉ cung cấp oxy cho tế bào mà còn ngăn chặn sựđóng cặn sinh khối tế bào. Tuy nhiên, nếu tốc độ sục khí và tốc độ khuấy quá cao sẽ làm cho tế bào bị biến dạng và phá vỡ thành tế bào. Những tế bào khi vỡ sẽ giải phóng polysaccharide tạo thành bọt, kết dính các mảnh vỡ tế bào lại với nhau và bám lên thành bình nuôi hoặc tạo thành lớp váng trên bề mặt môi trường. Lớp này ngăn cản sự lưu thông khí cần thiết gây ra sự thiếu không khí cho sinh trưởng tế bào (Ziv 2000) [193]. Ngoài ra, khi váng bọt nổi lên trên môi trường sẽ cuốn theo các tế bào làm cho các tế bào này không tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng và chết do thiếu hụt dinh dưỡng.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của tốc độ sục khí lên sinh trưởng của tế bào nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L
Tốc độ sục khí (l/phút) Khối lượng tươi (g) Khối lượng khô (g)
1,5 489,67c 36,9b
2,0 561,00b 50,84a
2,5 603,00a 53,25a
3,0 583,33b 50,33a
3,5 441,00d 33,17b
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
Ảnh hưởng của sự sục khí trong hệ lên men lên tích lũy sinh khối tế bào cũng đã được nghiên cứu ở nhiều loài thực vật. Lee và cs (2006) khi nuôi cấy tế bào cây Gymnema sylvestre trong hệ lên men 2 L cho thấy, tốc độ sục khí 0,1 L/L/phút là thích hợp nhất [78]. Thanh và cs (2005) đã khảo sát ảnh hưởng của nồng độ oxy (20,8-50%) đến sinh trưởng của tế bào cây nhân sâm nuôi cấy trong hệ lên men 5 L. Kết quả cho thấy, nồng độ oxy 40% là thích hợp nhất cho sản xuất sinh khối và chất ginsenoside, trong khi nồng độ oxy 20,8%, 30% và 50% là không thích hợp cho sinh trưởng của tế bào [159]. Như vậy, nhu cầu oxy của
65
mỗi loài thực vật là không giống nhau và nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố như lượng mẫu nuôi cấy; tốc độ sinh trưởng; hoạt tính sinh lý của tế bào; điều kiện môi trường xung quanh như nồng độ đường, các chất dinh dưỡng, và sự tích lũy các sản phẩm độc của quá trình trao đổi chất tế bào.
0 10 20 30 40 50 60 0 100 200 300 400 500 600 700 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Kh ố i l ượ ng k hô t ế bà o (g ) Kh ố i l ượ ng t ươ i t ế bào (g)
Thời gian nuôi cấy (ngày) Khối lượng tươi tế bào Khối lượng khô tế bào
Hình 3.9. Sinh trưởng của tế bào nghệ đen trong hê lên men nuôi cấy trên môi
trường MS có 3% sucrose; 0,5 mg/L BA; 1,5 mg/L 2,4-D ; khuấy 150 vòng/phút;
sục khí 2,5 L/phút, cỡ mẫu 200 g
3.4. KHẢO SÁT SỰ TÍCH LŨY MỘT SỐ HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆĐEN SINH HỌC TRONG TẾ BÀO NGHỆĐEN
3.4.1. Hàm lượng tinh dầu
Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệđen nuôi trong hệ lên men 10 L được trình bày ở bảng 3.14. Nhìn chung, hàm lượng tinh dầu (% khối lượng khô) của tế bào tăng dần từ 2-14 ngày nuôi cấy và đạt giá trị cực đại là 2,57% cao hơn của củ nghệ đen tự nhiên (1,61%) khoảng 1,6 lần (p<0,05). Hàm lượng tinh dầu tích lũy trong tế bào giảm nhanh sau 16 đến 18 ngày; đặc biệt sau 18 ngày nuôi cấy, hàm lượng tinh dầu chỉ còn 1,09% khối lượng khô. Điều này có thể giải thích là do sinh trưởng của tế bào nghệ đen sau khi đạt cực đại vào ngày thứ 14, tế bào có pha sinh trưởng ổn định rất ngắn, sau đó tế bào bước nhanh vào pha suy vong
66
sau 16 đến 18 ngày nuôi cấy (Hình 3.9); lúc đó hiện tượng phân hủy (tự phân) của tế bào diễn ra mạnh mẽ dẫn đến khả năng tích lũy tinh dầu trong tế bào cũng giảm theo rất nhanh.
Bảng 3.14. Hàm lượng tinh dầu của tế bào nghệđen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L
Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng tinh dầu (%)
2 1,41c 4 1,49c 6 1,57bc 8 1,98c 10 2,32b 12 2,42b 14 2,57a 16 1,68bc 18 1,09d MTN 1,61c
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
MTN:củ của cây nghệđen tự nhiên 01 năm tuổi
Nghiên cứu sự tích lũy tinh dầu trong tế bào thực vật nuôi cấy in vtro
cũng đã được nhiều tác giả công bố. Chẳng hạn, Figueiredo và cs (1995) nuôi cấy tế bào cây Achillea millefolium L. ssp. mille đã thu được hàm lượng tinh dầu 0,002% cao gấp 2 lần tinh dầu có trong cây tự nhiên, và thành phần tinh dầu cũng nhiều hơn. Nuôi cấy callus và huyền phù tế bào cây Origanum vulgare L. cho thấy, sự tích lũy tinh dầu đạt 0,095% (trong callus) và 0,06% (tế bào nuôi cấy huyền phù) cao hơn hàm lượng tinh dầu tích lũy trong tế bào của cây tự nhiên (chỉđạt 0,042%) (Arafeh và cs 2006).
Nghệđen là cây thảo dược có chứa tinh dầu bao gồm các chất thuộc nhóm sesquiterpene và monosesquiterpene [82]. Hàm lượng tinh dầu trong củ của cây nghệđen tự nhiên là 0,22% khối lượng tươi [1] hoặc xấp xỉ 1,5% khối lượng khô
67
[10]. Mau và cs (2003) nhận thấy, tinh dầu nghệ đen có hoạt tính tốt trong việc quét gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl [100]. Nghiên cứu của Trần Thị Việt Hoa và cs (2007) nhận thấy, tinh dầu nghệđen trồng ởĐà Lạt, Việt Nam có khả năng chống oxy hóa tương đối cao [3]. Với kết quả nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ đen là một phương thức triển vọng trong việc thu hồi nguồn tinh dầu có giá trị cao từ loài thảo dược này.
3.4.2. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số
Bảng 3.15 trình bày hàm lượng polysaccharide hòatan trong nước tổng số (% khối lượng khô) trong tế bào nghệ đen tại các thời điểm nuôi cấy khác nhau. Nhìn chung, hàm lượng polysaccharide tăng từ 2 - 10 ngày nuôi cấy và đạt cực đại là 6,55% thấp hơn khoảng 1,4 lần so với củ nghệđen (9,46%) (p<0,05). Hàm lượng polysaccharide của tế bào giảm sau 12 ngày nuôi cấy và giảm rất nhanh chỉđạt khoảng 1,6-2,01% trọng lượng khô sau 16 đến 18 ngày.
Bảng 3.15. Hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số của tế bào nghệ
đen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L
Thời gian nuôi cấy (ngày) Hàm lượng polysaccharide (%)
2 1,73e 4 2,23d 6 3,53cd 8 5,15bc 10 6,55a 12 5,76b 14 4,53c 16 2,01d 18 1,60e MTN 9,46g
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
68
Trong những thập kỷ gần đây, các polysaccharide có nguồn từ thực vật đã được chú ý đặc biệt trong lĩnh vực y sinh học bởi chúng có nhiều hoạt tính sinh học tốt trong điều trị bệnh và không có tính độc (Schepetkin và cs 2006). Nuôi cấy tế bào thực vật được xem là nguồn bổ sung có hiệu quả các sản phẩm tự nhiên từ thực vật, bao gồm polysaccharide. Cho đến nay, có hơn 130 loài thực vật đã được sử dụng trong nuôi cấy tế bào để sản xuất các polysaccharide có hoạt tính sinh học (Mahmoudifar và cs 2000). Gunter và cs (2003) đã nghiên cứu nuôi cấy tế bào cây Silene vulgaris nhằm sản xuất các polysaccharide [50]; Zhang và Zhong (2002) cũng đã dùng hệ lên men CIB (thể tích 30 L) nuôi cấy huyền phù tế bào cây tam thất để thu các chất hợp chất như saponin, polysaccharide với hàm lượng đạt được lần lượt 1,7 và 2,9 g/L [186].
Nhiều nghiên cứu cho thấy, polysaccharide của các loài thuộc chi nghệ như C. longa, C kwangsiensis, C. xanhthorrhiza có các hoạt tính quý: tăng cường khả năng miễn dịch, ức chế khối u, chống oxi hóa…(Zeng và cs 2002; Yuea và cs 2010). Ở cây nghệ đen, một số nghiên cứu cho thấy, các polysaccharide của nó có khả năng ức chế sinh trưởng của tế bào khối u, ngăn cản đột biến nhiễm sắc thể, kích thích chức năng của đại thực bào [75], [105], [169]. Wang và cs(2004) đã tách chiết của củ nghệđen tự nhiên bằng sắc ký cột và xác định hàm lượng polysaccharide tổng số là 33,12% [169]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi thì hàm lượng polysaccharide hòa tan trong nước tổng số của tế bào nghệđen nuôi cấy in vitrođạt 6,55% sinh khối khô, sau 10 ngày nuôi cấy là rất có triển vọng trong sản xuất các polysaccharide có hoạt tính sinh học của nghệ đen bằng con đường nuôi cấy tế bào.
3.4.3. Hàm lượng curcumin
Dựa trên kết quả nghiên cứu sinh trưởng của tế bào nghệđen trong hệ lên men 10 L, chúng tôi đã khảo sát sự tích lũy curcumin của chúng trong quá trình nuôi cấy. Kết quả phân tích HPLC được trình bày ở các hình 3.10-3.12 và bảng 3.16. Phổ HPLC của curcumin chuẩn có 1 đỉnh (peak) duy nhất ở thời gian lưu là
69
2,05 phút. Một peak có thời gian lưu tương đương cũng được tìm thấy ở dịch chiết của củ nghệ đen tự nhiên (2,08 phút) và tế bào nuôi cấy ở các thời gian khác nhau từ 2-18 ngày (1,97-2,09 phút). Phân tích HPLC cũng nhận thấy, đây là peak có diện tích lớn nhất trong phổ HPLC của tế bào in vitro cũng như củ nghệ tự nhiên. Dựa vào phổ HPLC của curcumin chuẩn, có thể xác định rằng, thành phần chính curcuminoid trong dịch chiết của tế bào nghê den nuôi cấy là curcumin, giống trong củ nghệđen tự nhiên.
Ngoài ra, phổ phân tích HPLC dịch chiết của củ nghệ đen tự nhiên còn có thêm 2 peak khác, một peak có thời gian lưu như peak thứ hai ở tế bào nuôi cấy (1,79 phút), peak còn lại có thời gian lưu là 1,21 phút. Dịch chiết tế bào nuôi cấy có một peak thứ ba rất nhỏ với thời gian lưu khoảng 1,6 phút. Sự biến mất của peak thứ ba 1,21 phút (ở dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên) trong tế bào in vitro có thể là do sự chuyển hóa sinh học của curcuminoid đã xảy ra trong nuôi cấy tế bào.