Dựa trên kết quả nghiên cứu sinh trưởng của tế bào nghệđen trong hệ lên men 10 L, chúng tôi đã khảo sát sự tích lũy curcumin của chúng trong quá trình nuôi cấy. Kết quả phân tích HPLC được trình bày ở các hình 3.10-3.12 và bảng 3.16. Phổ HPLC của curcumin chuẩn có 1 đỉnh (peak) duy nhất ở thời gian lưu là
69
2,05 phút. Một peak có thời gian lưu tương đương cũng được tìm thấy ở dịch chiết của củ nghệ đen tự nhiên (2,08 phút) và tế bào nuôi cấy ở các thời gian khác nhau từ 2-18 ngày (1,97-2,09 phút). Phân tích HPLC cũng nhận thấy, đây là peak có diện tích lớn nhất trong phổ HPLC của tế bào in vitro cũng như củ nghệ tự nhiên. Dựa vào phổ HPLC của curcumin chuẩn, có thể xác định rằng, thành phần chính curcuminoid trong dịch chiết của tế bào nghê den nuôi cấy là curcumin, giống trong củ nghệđen tự nhiên.
Ngoài ra, phổ phân tích HPLC dịch chiết của củ nghệ đen tự nhiên còn có thêm 2 peak khác, một peak có thời gian lưu như peak thứ hai ở tế bào nuôi cấy (1,79 phút), peak còn lại có thời gian lưu là 1,21 phút. Dịch chiết tế bào nuôi cấy có một peak thứ ba rất nhỏ với thời gian lưu khoảng 1,6 phút. Sự biến mất của peak thứ ba 1,21 phút (ở dịch chiết củ nghệ đen tự nhiên) trong tế bào in vitro có thể là do sự chuyển hóa sinh học của curcuminoid đã xảy ra trong nuôi cấy tế bào.
Bảng 3.16. Hàm lượng curcumin của tế bào nghệđen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L
Thời gian nuôi
cấy (ngày) lThưu (phút) ời gian Diện tích peak (mAU) curcumin (%) Hàm lượng
2 2,09 1909 0,44g 4 1,98 2226 0,52e 6 2,05 2285 0,53e 8 2,00 2442 0,56e 10 1,97 4244 0,98b 12 1,99 4448 1,03b 14 2,07 5034 1,16a 16 1,99 3631 0,84c 18 2,07 2573 0,60d MTN 2,06 1868 0,43g
Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở
p<0,05 (Duncan’s test).
70
Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.16 cho thấy, hàm lượng curcumin (theo % khối lượng khô) tích lũy trong tế bào tăng dần từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 14, đạt cực đại là 1,16%, sau đó giảm từ ngày 16-18 cùng với sinh trưởng của tế bào (Hình 3.9). Nhìn chung, hàm lượng curcumin trong tế bào ở các thời gian nuôi cấy khác nhau đều cao hơn trong củ nghệđen tự nhiên (0,43%), lúc cao nhất gấp khoảng 2,7 lần.
Thông thường, các hợp chất thứ cấp tích lũy nhiều nhất vào cuối giai đoạn sinh trưởng cực đại. Đã có những bằng chứng rõ ràng cho thấy có mối quan hệ ngược giữa tốc độ sinh trưởng và khả năng sản xuất các chất thứ cấp. Khi tốc độ sinh trưởng cao, các quá trình sơ cấp của tế bào là phân chia tế bào và sản xuất sinh khối tế bào đã diễn ra mạnh mẽ. Ngược lại, trong pha tĩnh khi sự sinh trưởng giảm, lúc này hoạt động sản xuất và tích lũy các chất thứ cấp mới tăng lên [7]. Nghiên cứu quá trình sinh trưởng của tế bào nghệ đen nuôi trong hệ lên men cho thấy, pha sinh trưởng ổn định của tế bào rất ngắn, sau khi tế bào sinh trưởng cực đại thì sinh khối giảm ngay (từ ngày thứ 14 đến 16) (Hình 3.9). Vì vậy, hàm lượng curcumin được tổng hợp cao nhất vào cuối giai đoạn tế bào sinh trưởng cực đại (14 ngày) là hợp lý. Kết quả này của chúng tôi cũng tương tự kết quả nghiên cứu khả năng sản xuất jaceosidin của tế bào S. medusa. Hàm lượng jaceosidin và sinh khối tế bào đều đạt cực đại vào ngày thứ 14 của quá trình nuôi cấy [189].
Ngoài ra, quá trình tích lũy các hợp chất thứ cấp không giống nhau giữa các loài, không phải loài thực vật nào cũng tăng tích lũy các hợp chất thứ cấp khi sinh trưởng của tế bào đi vào pha ổn định. Khi nuôi cấy tế bào T. cordifolia, Rao và cs (2008) nhận thấy rằng trong khi khối lượng khô tế bào đạt cực đại (9,9 g/L) sau 36 ngày nuôi cấy, thì hàm lượng berberine trong tế bào lại thu được cao nhất vào ngày 24 trong pha log của tế bào [130]. Mặt khác, nhiều nghiên cứu cho thấy, tế bào nuôi cấy huyền phù có khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp cao hơn so với cây tự nhiên, chẳng hạn như tế bào in vitro của cây Solanum chrysotrichum có hàm lượng sprirostanol saponin khoảng 14 mg/g, cao gấp 50 lần so với hàm lượng
71
của nó trong lá cây tự nhiên (Villarreal và cs 1997) [168], hoặc tế bào cây dừa cạnnuôi cấy in vitro cũng có lượng vincristin cao hơn lá tự nhiên [5].
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng, curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng [55], [66], [152]; chống đông máu và hạ huyết áp; chống viêm nhiễm, kháng oxy hóa và bảo vệ tế bào [152]. Syu và cs (1998) nghiên cứu đã nhận thấy, dịch chiết ethanol của củ nghệ đen có chứa curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin [152]. Paramapojn và Gritsanapan (2007) phân tích HPLC thành phần curcuminoid trong củ nghệ đen của Thái Lan cho thấy, hàm lượng curcumin, demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin lần luợt từ 1,46% đến 5,73% w/w (trung bình 2,73% w/w); từ 3,15% đến 10,98% w/w (7,37%) và từ 0,49% đến 2,99% w/w (1,40% w/w) [119]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, curcumin tích lũy trong tế bào nghệ đen nuôi cấy in vitro với hàm lượng khá cao (1,16%), điều này có khả năng gợi ý tế bào nghệ đen in vitro có triển vọng là nguồn nguyên liệu thích hợp để sản xuất curcumin, vì chỉ cần trong thời gian ngắn khoảng 2 tuần là đã có thể tạo được nguyên liệu sản xuất thay vì trong tự nhiên trồng phải mất hàng năm mới có.
72
73
Hình 3.12. Phổ HPLC curcumin của tế
bào nghệđen sau 2-18 ngày nuôi cấy
trong hệ lên men 10 L
3.4.4. Xác định sesquiterpene
Sesquiterpennoid là các hợp chất C15 được tạo thành bởi liên kết của 3 đơn vị isoprenoid. Chúng có mặt trong nhiều tổ chức sống bao gồm thực vật bật cao. Khoảng 140 hợp chất sesquitertene khác nhau được tách chiết từ chi Curcuma và được chia thành 10 nhóm cấu trúc khác nhau. Tuy nhiên, hầu hết các hợp chất này nằm trong 3 nhóm chính là bisabolane, germacrane và guaiane.
74
Sự phân bố của sesquiterpene trong tế bào nghệ đen được phân tích bằng HPLC. Kết quả cho thấy, sự hiện diện của các peak phân tách trong củ nghệ tự nhiên nhiều hơn trong tế bào huyền phù (Hình 3.13). Nhìn chung, các peak có thời gian lưu liên quan với các hợp chất sesquiterpene (được đánh số từ 1-9) trong củ nghệ và tế bào huyền phù có chiều cao phổ hấp thụ (mAU) khác nhau, đặc biệt là peak số 1 và 4 (Bảng 3.17). Chẳng hạn, peak số 1 (thời gian lưu 4,7 phút) có độ hấp thụ là 6,05 mAU trong củ nghệ nhưng chỉđạt 2,55 mAU trong tế bào huyền phù, ngược lại peak số 4 (thời gian lưu 7,5 phút) ở tế bào huyền phù có độ hấp thụ là 7,33 mAU còn củ nghệ là 2,23 mAU. Một số peak hiện diện trong củ nghệ (5-8) thì không có hoặc chỉ có ở dạng vết (< 1 mAU) trong tế bào huyền phù. Tuy nhiên, ở tế bào huyền phù lại xuất hiện những peak mới (không đánh số) với các thời gian lưu xấp xỉ 6,8; 7,8; 8,2 và 9,2 phút tương ứng với độ hấp thụ 1,38-4,10; 5,62-7,54; 1,70-8,41 và 1,06-8,38 mAU. Kết quả này cho thấy, trong quá trình nuôi cấy tế bào đã xuất hiện sự chuyển hóa sinh học của các sesquiterpen, tạo ra những hợp chất sesquiterpen khác so với củ nghệ tự nhiên.
Bảng 3.17. Chiều cao phổ hấp thụ (mAU) của sesquiterpene trong tế bào nuôi cấy
ở hệ lên men 10 L và tế bào củ nghệ tự nhiên
Hợp chất sesquiterpene (số)/thời gian lưu (phút) Thời gian nuôi cấy (ngày) 1/4,7 2/5,1 3/6,0 4/7,5 5/12,7 6/13,8 7/19,2 8/20,5 9/26,7 2 2,11 - 2,49 5,99 - vết vết vết - 4 1,93 - 2,23 5,76 - vết vết vết - 6 1,15 vết 2,81 3,17 - vết - - - 8 1,06 - 1,54 3,57 - - - 10 1,22 - 1,02 4,05 - vết vết - - 12 1,04 vết 2,14 3,29 - vết - vết - 14 2,55 1,59 - 7,33 - vết - vết - 16 1,58 - 3,82 4,04 - vết - - - 18 2,36 1,15 1,15 5,11 - vết - vết - MTN 6,05 2,59 2,15 2,23 6,23 1,46 3,59 1,29 1,19 MTN:củ của cây nghệđen 01 năm tuổi
76
Hình 3.13. Phổ HPLC của sesquiterpene. A: Củ nghệ đen tự nhiên; B: tế bào
nghệđen nuôi cấy trong hệ lên men 10 L từ 2 đến18 ngày
Sakui và cs (1992) đã nuôi cấy tế bào callus nghệ đen hơn 2 năm để khảo sát sự chuyển hóa sinh học của sesquiterpene và chứng minh có sự chuyển hóa sesquiterpen mạch vòng thành viên số 10 thuộc nhóm germacrone thành sesquiterpene thuộc nhóm guaiane. Chuyển hóa sinh học trong nuôi cấy in vitro
tế bào thực vật cũng đã được thông báo ở nhiều loài chẳng hạn, Sakamoto và cs (1994) nuôi cấy tế bào của các cây Lonicera japonica, Bupleurum falcatum,
Polygonum tinctorium và Solidago altissima đã nhận thấy có sự chuyển hóa germecrone thành guaiane, eudesmane và secoguaiane; Hashimoto và cs (1999) nuôi cấy tế bào cây Heteroscyphus planus nhận thấy có sự chuyển hóa cubenene thành 7-hydroxycalamene; Chuyển hóa geranyl acetate và linalyl acetate thành geraniol, linalool, a-terpineol cũng đã xuất hiện trong nuôi cấy tế bào cây
Peganum harmala [192]. Như vậy, nuôi cấy tế bào thực vật được xem là một phương thức hiệu quả sản xuất các hợp chất thứ cấp cũng như các chất chuyển hóa của chúng (Rao và Ravishankar, 2002). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy có sự tích lũy một số hợp chất sesquiterpene trong tế bào nghệđen nuôi cấy in vitro
giống như trong củ nghệ tự nhiên, đồng thời trong tế bào cũng đã xuất hiện một số sesquiterpene khác với củ tự nhiên (có thể do chuyển hóa sinh học); kết quả này có thể gợi ý quan trọng trong sản xuất sesquiterpene cũng như các hợp chất thứ cấp mới có hoạt tính sinh học quý thông qua nuôi cấy huyền phù tế bào cây nghệđen.
77