Nấm gây mốc thuốc lá nguyên liệu ựược phát hiện bằng phương pháp ựể ẩm. Mẫu lá ựược ựể trong hộp petri có lót giấy thấm ựể ẩm bằng nước cất vô trùng. Sau 2 ngày ủ ở nhiệt ựộ phòng, thành phần nấm ựược xác ựịnh bằng kắnh hiển vi quang học dựa theo ựặc ựiểm hình thái của nấm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 31
3.5.2.1. Phương pháp phân lập nấm
Các nấm quan trọng sẽ ựược phân lập thuần nhằm ựánh giá ựặc ựiểm hình thái và làm nguồn cho các thắ nghiệm phòng trừ.
Mẫu nấm ựược phân lập từ vết bệnh thuốc lá bảo quản sử dụng môi trường WA (water agar) và PDA (potato dextrose agar).
+ Cách chế tạo môi trường WA (Agar: 20 g và Nước: 1000 ml). đun tan agar trong 800 mL nước. Bổ xung nước cho ựủ 1000 ml. Hấp khử trùng ở 121oC /20 phút. để nguội 55-60 OC trước khi rót ra ựĩa petrị
+ Cách chế tạo môi trường PDA (Khoai tây: 200g, Dextrose D-glucose): 20 g, Agar: 20 g và Nước: 1000 ml). Khoai tây rửa sạch, cắt lát, ựun trong nước 1 giờ. Lọc qua vải lọc, bổ sung agar vào dịch lọc, ựun cho tan agar. Bổ xung nước cho ựủ 1000ml. Hấp khử trùng ở 121oC/20 phút. để nguội 55- 600C trước khi rót ra ựĩa petrị
Trình tự phân lập nấm
Chuẩn bị:
ỚDao mổ, kéo, panh, que cấy nấm
Ớđèn cồn, giấy thấy thấm vô trùng, thớt nhựa, ựĩa môi trường
ỚHoá chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%, NaOCl hoặc CăOCl)2 1-2 %
Trình tự:
ỚChọn mẫu bệnh có triệu chứng ựiển hình
ỚCắt chọn mảnh mô bệnh thắch hợp
ỚKhử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl hoặc CăOCl)2 1-2 %. Thời gian khử trùng từ 1/2-3.
ỚRửa lại bằng nước cất vô trùng
ỚThấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng
ỚCắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1-3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 32 ỚDùng panh vô trùng ựặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường WẠ
ỚGhi chú cẩn thận bằng bút viết kắnh: Ngày, cây, bệnh...
ỚTheo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm ựã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần ựỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường PDA
3.5.2.2. Phương pháp ựịnh loại nấm
* Phương pháp ựịnh loại nấm theo ựặc ựiểm hình thái theo các tài liệu ựịnh loại nấm bất toàn của Barnett & Hunter (1998), Singh et al. (1991).
* Phương pháp xác ựịnh tên nấm bằng PCR và giải trình tự
Các gen mã hóa RNA ribosome (rRNA hay rDNA) của nấm cũng như của các sinh vật nhân thật (Eukaryote) ựược tổ chức thành các ựơn vị phiên mã. Mỗi ựơn vị phiên mã có thể ựược lặp lại nhiều lần trên bộ genomẹ Về cấu trúc, ở sinh vật nhân thật, các ựơn vị phiên mã thường lặp lại nhiều lần và kề nhau thành các cụm ựơn vị phiên mã. Một ựơn vị phiên mã gồm các gen xếp theo thứ tự là 18S-5.8S-26S. Xung quanh vùng gen 5.8S là 2 vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) ký hiệu là ITS1 (ở ựầu 5Ỗ) và ITS2 (ở ựầu 3Ỗ).
Các vùng ITS, do có tốc ựộ ựột biến nhìn chung tương ứng với tốc ựộ biệt hóa loài (tiến hóa trung tắnh) nên có thể phân biệt mối quan hệ tới mức loàị Chúng tôi chọn vùng gen rDNA ựể giải trình tự nhằm xác ựịnh danh tắnh nấm theo sơ ựồ hình 1
Hình 3.1. Sơ ựồ tổ chức cụm gen RNA ribosome của sinh vật nhân thật và vị trắ mồi cũng như kắch thước sản phẩm PCR
18S 26S P1 ITS5 ~ 0.8 kb 5.8S ITS1 ITS2 ITS4
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 33
- Tinh chiết DNA của nấm
Ớ Chuẩn bị 400 - 500ộl ựệm chiết CTAB nóng 600C chứa βME (1ml CTAB + 10ộl βME)
Ớ Sử dụng que cấy vô trùng ựể lấy tản nấm trên bề mặt môi trường PDA (khoảng bằng ựầu que diêm) rồi cho vào tuýp nhựa 1.5ml.
Ớ Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn khối sợi nấm.
Ớ Bổ sung 500 ộl ựệm chiêt CTAB.
Ớ Ủ trong 600C. Sau 10 Ờ 20 phút thì cho vào ly tâm, lấy dịch kết tủạ
Ớ Chiết hai lần bằng chloroform: isoamyl alcohol (24:1).
Ớ Rửa hai lần bằng Ethanol 70%.
Ớ Làm khô cặn trong không khắ.
Ớ Hoà trong 50ộl ựệm TE và bảo quản ở -200C. - Phản ứng PCR
Ớ Mồi sử dụng: Cặp mồi nhằm nhân các ựoạn DNA ITS của nấm (White et al., 1990): ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC).
ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG).
Ớ Phản ứng PCR
Các phản ứng PCR ựược thực hiện trong tube 0.5 mL với tổng thể tắch phản ứng 25 ộL chứa 2.5 ộL dung dịch ựệm PCR X10 (Fermantas), 0.5 ộL dNTPS (10 mM môi loại A, T, G, C, Roche), 0.5 ộL mỗi loại mồi ựặc hiệu xuôi dòng và ngược dòng (20 ộM), 1.5 ộL MgCl2, 0.25 ộL Taq polymerase (Fermentas) và 0.5 ộL DNẠ
Phản ứng PCR ựược thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với ựiều kiện sau: khởi ựầu biến tắnh ở 940C trong 5 phút; tiếp theo là 35 chu trình PCR với nhiệt ựộ biến tắnh ở 940C trong 30 giây, gắn mồi ở 500C trong 40 giây, tổng hợp ở 720C trong 1 phút. Phản ứng ựược kết thúc với 5 phút ở 72oC.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 34
Sản phẩm PCR ựược ựiện di trên gel agarose 1 % ựươc chuẩn bị bằng ựệm TAE và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromidẹ Gel ựược chạy trên thiết bị ựiện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với ựệm TAE ở ựiện thế 100 V trong 30 - 40 phút. Bản gel ựược kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và ựược chụp bằng máy ảnh số.
- Giải trình tự chuỗi ITS
Sản phẩm PCR ựược tinh chiết từ gel agarose dùng kắt tinh chiết PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR tinh chiết ựược giải trình tự trực tiếp bằng mồi ITS và ựược ựọc tại Viện Công nghệ sinh học (Hà Nội)
- Phân tắch trình tự: Các chuỗi mẫu ựược xác ựịnh danh tắnh khi so sánh với các chuỗi ựã công bố từ trước nhờ phần mềm tìm kiếm BLAST tại NCBI (the National Center for Biotechnology Information
(http://www.ncbịnlm.nih.gov/BLAST/)
