Gen asp1 sau tổng hợp sẽ đƣợc nhân dòng rồi đƣa trực tiếp vào vector biểu hiện pPIC9 để biểu hiện trong P. pastoris. Do đó, một số thay đổi nhỏ đã đƣợc đƣa vào gen asp1 để tạo thuận lợi trong các thao tác sinh học phân tử trong quá trình
tách dòng gen và tạo chủng tái tổ hợp sau này.
AACTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCGAACGTCACCTATGTGTTCACCAACCCCAAT GGCCTGAACTTTACTCAGATGAACACCACCCTGCCAAACGTCACTATCTTCGCTACAGGC GGCACAATCGCTGGCTCCAGCGCCGACAACACCGCAACAACAGGTTACAAAGCCGGTGCA GTCGGCATCCAGACACTGATCGACGCTGTCCCGGAAATGCTAAACGTTGCCAACGTCGCT GGCGTGCAAGTAACCAATGTCGGCAGCCCAGACATCACCTCCGACATTCTCCTGCGTCTC TCCAAACAGATCAACGAGGTGGTCTGCAACGACCCCACCATGGCCGGTGCAGTGGTCACC CACGGCACCGACACGCTCGAAGAATCCGCCTTCTTCCTCGACGCCACGGTCAACTGTAGA AAGCCCGTGGTCATCGTCGGCGCCATGAGACCTTCAACCGCCATCTCGGCTGACGGCCCC CTCAACCTCCTGCAATCCGTCACCGTCGCCGCTAGCCCCAAGGCCCGAGACAGAGGCGCC CTGATTGTCATGAACGACAGAATCGTATCCGCCTTCTACGCCTCCAAGACGAACGCCAAC ACCGTCGATACATTCAAGGCCATCGAAATGGGTAACCTGGGCGAGGTCGTCTCCAACAAA CCCTACTTCTTCTACCCCCCAGTCAAGCCAACAGGCAAGACGGAAGTAGATATCAGAAAC ATCACCTCCATCCCCAGAGTCGACATCCTCTACTCATACGAAGACATGCACAATGACACC CTTTACTCCGCCATCGACAACGGCGCAAAGGGCATCGTTATCGCCGGCTCCGGCTCCGGC TCCGTCTCCACCCCCTTCAGCGCCGCCATGGAAGACATCACAACCAAACACAACATCCCC ATCGTAGCCAGCACGAGAACCGGAAACGGGGAGGTGCCGTCCTCCGCCGAGTCGAGCCAG ATCGCAAGCGGGTATTTGAACCCCGCAAAGTCAAGAGTTTTGCTTGGCTTGTTGCTTGCC CAGGGGAAGAGTATTGAGGAAATGAGGGCTGTTTTTGAGAGAATTGGGGTTGCTTAAGCG GCCGCGAAA
Hình 13 .Trình tự gen asp1 cần đặt có chứa thêm trình tự mã hóa cho vị trí cắt của
tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc gạch chân), vị trí cắt của enzyme giới hạn
XhoI, NotI (đƣợc tô đậm)
Vùng gen cần đặt đƣợc đƣa thêm các trình tự nhƣ sau:
- Thứ nhất, trình tự gen asp1 không cần mang mã mở đầu (ATG) ở đầu 5’vì dự định gen sẽ đƣợc phiên mã từ mã khởi đầu của trình tự peptide tín hiệu trên vector pPIC9.
- Thứ hai, để đảm bảo sau khi cắt bỏ tín hiệu tiết, enzyme đƣợc tiết ra môi trƣờng là enzyme nguyên vẹn có trình tự amino acid chính xác nhƣ trình tự của
43
asparaginase nguyên thủy, gen sẽ đƣợc đƣa vào vector pPIC9 tại vị trí của enzyme
XhoI trên vector, nằm trƣớc trình tự cắt của peptide tín hiệu. Vì vậy, toàn bộ vùng
gen từ trình tự nhận biết của XhoI tới vị trí cắt của peptide tín hiệu
(GAGAAAAGAGAGGCTGAAGCT) sẽ đƣợc đƣa vào trình tự gen asp1 để tổng
hợp.
-Thứ ba, trình tự nhận biết của hai enzyme hạn chế đƣợc dùng để đƣa gen
asp1 vào vector pPIC9 cũng đƣợc đƣa vào trình tự tổng hợp: trình tự nhận biết của XhoI (CTCGAG) đƣợc đƣa vào đầu 5’ và trình tự nhận biết của NotI
(GCGGCCGC) vào đầu 3’.
- Thứ tƣ, mã kết thúc (TAA) cũng đã thay thế cho mã kết thúc (TGA) để làm tăng khả năng biểu hiện gen asp1 trong P. pastoris.
Nhƣ vậy, cấu trúc mang gen asp1 cần đặt để tổng hợp là XhoI – tín hiệu tiết – asp1 – NotI với tổng chiều dài 1088 bp (Hình 13).