Nguyên lý
Các protein khác nhau có điện tích và hình dạng khác nhau, vì vậy chúng không thể di chuyển vào gel polyacrylamide với tốc độ nhƣ nhau. Mẫu protein trƣớc khi điện di cần phải đƣợc biến tính với sự có mặt của SDS. SDS là một chất tích điện
32
âm có khả năng gây biến tính protein bằng cách bao bọc xung quanh chuỗi polypeptide dẫn đến các phân tử protein trở thành dạng thẳng và tích điện âm. Do đó, sự di chuyển của các protein khác nhau đƣợc phân biệt chỉ dựa vào trọng lƣợng phân tử mà không phụ thuộc vào điện tích hay hình dạng của chúng [56].
Quy trình
a. Điện di biến tính trên gel polyacrylamide
Sau khi nuôi cấy ở điều kiện cảm ứng, dịch nuôi cấy thu lại sau khi đã ly tâmloại bỏ tế bào. Protein đƣợc xử lý biến tính bằng đệm xử lý mẫu ( treatment buffer 6X) và ủ ở 100oC trong 10 phút. Chuẩn bị gel poly-acrylamide, tiến hành lắp bản gel, tra mẫu vào giếng và chạy với cƣờng độ dòng điện 10mA cho mỗi bản gel cho đến khi mẫu qua hết lớp gel cô. Sau đó cƣờng độ dòng điện đƣợc tăng lên 20mA cho mỗi bản gel khi mẫu đến lớp gel tách. Gỡ bản gel và nhuộm gel với bạc.
b. Nhuộm bạc
Ngâm bản gel sau khi đƣợc gỡ ra khỏi giá bằng dung dịch cố định gel trong thời gian hơn 1 giờ. Sau đó rửa bản gel 2 lần với dung dịch rửa, mỗi lần 20 phút để bỏ acetic acid, các chất bẩn dạng vết và phần thừa của các thành phần gel hòa tan sau khi cố định. Chuyển bản gel vào dung dịch tăng độ nhạy trong 1 phút và rửa nhanh với nƣớc cất trong 3 lần mỗi lần 20 giây. Tiếp tục chuyển bản gel vào dung dịch nhuộm bạc trong thời gian từ 20-30 phút, rửa bản gel 2 lần bằng nƣớc cất mỗi lần 20 giây để loại bỏ thuốc nhuộm thừa có thể gây ra kết tủa màu nâu trong quá trình phát triển màu. Chuyển bản gel vào dung dịch hiện màu cho đến khi băng protein xuất hiện, rửa lại bản gel 3 lần bằng nƣớc cất, mỗi lần 20 giây. Dừng phản ứng phát triển màu khi thu đƣợc hình ảnh tối ƣu càng nhanh càng tốt bằng cách đặt bản gel vào dung dịch dừng phản ứng trong 10 phút.