và thử hoạt tính bằng đặt gel trên đĩa thạch
Nguyên lý
Gel poly-acrylamide và đệm chạy không chứa SDS thì sau khi chạy điện di xong mẫu protein vẫn giữ đƣợc hoạt tính ban đầu. Để thử hoạt tính asparaginase
33
tiến hành đặt bản gel chạy điện di không biến tính lên đĩa thạch có chứa phenol đỏ và cơ chất asparagine.
Phenol đỏ là một chất chỉ thị pH thƣờng dùng trong các phòng sinh học phân tử tế bào, khi gặp môi trƣờng có pH lớn hơn 8,2 sẽ chuyển sang màu hồng đậm với môi trƣờng có pH nhỏ hơn 6,8 sẽ chuyển sang màu vàng, trong khoảng 6,8 đến 8,2 sẽ có màu cam. Phản ứng cơ chất của enzyme asparaginase với cơ chất asparagine tạo ra sản phẩm là acid aspatic và ammomium. Sau phản ứng ammonium sẽ bay hết, để lại trên đĩa thạch acid aspatic do vậy xuất hiện băng màu vàng nhạt, trong sau khi ủ 20 phút ở nhiệt độ 37oC [57].
Quy trình
Chạy điện di không biến tính hai bản gel giống nhau (Sau khi chạy xong một bản gel đƣợc nhuộm coommasie; bản còn lại đƣợc rửa bằng nƣớc cất trong 15 phút, 2 phút thay nƣớc một lần). Trong quá trình điện di, đổ đĩa thạch chứa asparagine và phenol đỏ với thành phần: agar 1,8%: 10 ml; phenol đỏ 2,5%: 2,5 ml; asparagine 2,5%: 8 ml; nƣớc cất: 20ml. Sau khi rửa xong bản gel và đĩa thạch đã khô, ép bản gel vừa rửa lên đĩa thạch và ủ ở 37oC trong 20 phút. Quan sát vùng biến đổi pH trên đĩa thạch.
34
Chƣơng 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Chế phẩm asparaginase tái tổ hợp có nguồn gốc từ A. oryzae đã đƣợc Tổ chức Y tế thế giới và Tổ chức Nông Lƣơng thế giới chứng nhận là enzym an toàn dùng trong thực phẩm. Vì vậy việc lựa chọn gen asparaginase từ A. oryzae để biểu hiện sẽ giúp giảm đƣợc thời gian và kinh phí để đánh giá đặc tính enzyme và tính an toàn của enzyme, trong khi đó hệ thống đánh giá tính an toàn trong nƣớc chƣa đƣợc chuẩn hóa và chƣa đƣợc WHO/FAO chứng nhận.
Tuy nhiên, việc tổng hợp A. oryzae asparaginase tái tổ hợp trong chủng nấm sợi A. oryzae trong điều kiện nghiên cứu ở Việt Nam gặp nhiều khó khăn do chủng biểu hiện A. oryzae và vector biểu hiện trong chủng A. oryzae không đƣợc thƣơng
mại hóa trên thị trƣờng. Do đó, chủng nấm men P. pastoris là chủng an toàn trong thực phẩm đƣợc chọn để thay thế cho chủng nấm sợi A. oryzae. Vấn đề gặp phải chỉ số phù hợp codon (CAI) của gen trong chủng chủ thấp và tỷ lệ các bộ mã hiếm trên gen cao, do đó để có thể biểu hiện tốt trong chủng nấm men P. pastoris, gen mã hóa cho asparaginase của A. oryzae cần phải đƣợc thay thế các mã bộ ba hiếm thành các bộ có tần số sử dụng tốt trong nấm men P. pastoris nhƣng không làm thay đổi trình tự amino acid.
Trong nghiên cứu này gen mã hóa asparaginase của nấm men A. oryzae đƣợc cải biến 13 mã bộ ba hiếm để phù hợp cho việc biểu hiện gen trong nấm men P. pastoris và trong trình tự gen chúng tôi đƣa thêm vị trí cắt của enzyme giới hạn XhoI và NotI ở hai đầu gen, tạo điều kiện cho việc đƣa gen vào vector pPIC9. Gen
cải biến đƣợc đặt tên là asp1 và đƣợc hãng Genscript tổng hợp, tách dòng trong vector pUC57.
35
Hình 5. Sơ đồ tóm tắt quá trình thiết kế vector biểu hiện để biểu hiện gen asp1
trong tế bào nấm men P. pastoris SMD1168
Sau khi nhận đƣợc vector tách dòng mang gen, chúng tôi đã tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp pUC-asp1 vào tế bào E. coli DH10b để nhân dòng gen với số lƣợng lớn. Sau đó, gen asp1 từ pUC-asp1 và vector biểu hiện pPIC9 đƣợc cắt bằng enzyme XhoI và NotI và đƣợc tinh chế lại, tiến hành nối ghép tạo vector pPIC-asp1. Sản phẩm nối ghép đƣợc biến nạp vào tế bào E. coli DH10b để chọn dòng tế bào mang pPIC-asp1. Để định hƣớng plasmid pPIC-asp1 tích hợp vào hệ gen của P. pastoris, pPIC-asp1 đƣợc cắt mở vòng bằng enzyme StuI trên vùng gen HIS4 và
biến nạp vào tế bào nấm men P. pastoris bằng phƣơng pháp xung điện. Các dòng tế bào nấm men P. pastoris tái tổ hợp đƣợc nuối cấy trên môi trƣờng chọn lọc khuyết
36
dƣỡng histidin. Sau khi nhận đƣợc các thể biến nạp, chúng tôi lựa chọn các dòng tái tổ hợp có kiểu hình Mut+
để tiến hành biểu hiện gen trong các chủng nấm men này có bổ sung methanol 0,5% trong vòng 72 giờ để biểu hiện gen asparaginase. Toàn bộ quá trình thiết kế vector biểu hiện và biểu hiện gen asp1 trong nấm men P. pastoris đƣợc trình bày ở hình 5.