Hình 6. Đồ thị dự đoán sự có mặt, vị trí và điểm cắt tín hiệu tiết có trong asparaginase của A. oryzae
Gen asparaginase của A. Oryzae dài 1137 nucleotide mã hóa protein gồm 378 amino acid. Tuy nhiên, protein đƣợc tổng hợp từ chủng tái tổ hợp A. oryzae có khả năng bị cắt ở đầu N ở bốn vị trí khác nhau, cho ra protein với bốn đầu N bị cắt cụt ở các vị trí amino acid thứ 27, 30, 75 và 80 nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc hoạt tính sinh học của enzyme. Vì vậy kích thƣớc của asparaginase có hoạt tính sinh học nằm trong khoảng từ 31,5-37 kDa [10]. Để biểu hiện gen asparaginase của A. oryzae
37
trong nấm men và tiết thành công sản phẩm protein ra ngoại bào tạo thuận tiện cho quá trình thu hồi enzyme, các trình tự tín hiệu tiết không đặc hiệu cần phải đƣợc loại bỏ bởi vì chúng có thể làm giảm hiệu quả quá trình tiết sản phẩm protein ra ngoại bào. Tín hiệu tiết này đƣợc chúng tôi dự đoán bằng phần mềm Predisi (prediction of signal peptides). Kết quả cho thấy, đoạn đầu N có chứa trình tự tín hiệu và có điểm cắt đoạn tín hiệu tiết ở vị trí amino acid thứ 19 (Hình 6). Do vậy, để loại bỏ tín hiệu tiết này đồng thời làm giảm khả năng bị cắt sau khi tổng hợp nhƣng vẫn đảm bảo đƣợc hoạt tính sinh học của aspraginase, chúng tôi đã quyết định loại bỏ đoạn trình tự gồm 90 nucleotide đầu tiên tƣơng ứng với vị trí cắt thứ hai ở amino acid thứ 30 bao gồm cả tín hiệu tiết nguyên thủy của gen và vị trí cắt không đặc hiệu trên asparaginase. Vì vậy, đoạn gen asp đƣợc biểu hiện trong đề tài có trình tự từ nucleotide 91-1137 (Hình 7). 91 – TCGAACGTCACCTATGTGTTCACCAACCCCAAT 123 GGCCTGAACTTTACTCAGATGAACACCACCCTGCCAAACGTCACTATCTTCGCGACAGGC 183 GGCACAATCGCGGGCTCCAGCGCCGACAACACCGCAACAACAGGTTACAAAGCCGGTGCA 243 GTCGGCATCCAGACACTGATCGACGCGGTCCCGGAAATGCTAAACGTTGCCAACGTCGCT 303 GGCGTGCAAGTAACCAATGTCGGCAGCCCAGACATCACCTCCGACATTCTCCTGCGTCTC 363 TCCAAACAGATCAACGAGGTGGTCTGCAACGACCCCACCATGGCCGGTGCAGTGGTCACC 423 CACGGCACCGACACGCTCGAAGAATCCGCCTTCTTCCTCGACGCCACGGTCAACTGTCGC 483 AAGCCCGTGGTCATCGTCGGCGCCATGCGCCCTTCAACCGCCATCTCGGCTGACGGCCCC 543 CTCAACCTCCTGCAATCCGTCACCGTCGCCGCGAGCCCCAAGGCCCGAGACCGCGGCGCC 603 CTGATTGTCATGAACGACCGCATCGTATCCGCCTTCTACGCCTCCAAGACGAACGCCAAC 663 ACCGTCGATACATTCAAGGCCATCGAAATGGGTAACCTGGGCGAGGTCGTCTCCAACAAA 723 CCCTACTTCTTCTACCCCCCAGTCAAGCCAACAGGCAAGACGGAAGTAGATATCCGGAAC 783 ATCACCTCCATCCCCAGAGTCGACATCCTCTACTCATACGAAGACATGCACAATGACACC 843 CTTTACTCCGCCATCGACAACGGCGCAAAGGGCATCGTTATCGCCGGCTCCGGCTCCGGC 903 TCCGTCTCCACCCCCTTCAGCGCCGCCATGGAAGACATCACAACCAAACACAACATCCCC 963 ATCGTAGCCAGCACGCGCACCGGAAACGGGGAGGTGCCGTCCTCCGCCGAGTCGAGCCAG 1023 ATCGCAAGCGGGTATTTGAACCCCGCAAAGTCACGCGTTTTGCTTGGCTTGTTGCTTGCC 1083 CAGGGGAAGAGTATTGAGGAAATGAGGGCGGTTTTTGAGCGGATTGGGGTTGCTTGA 1137
Hình 7. Trình tự đoạn gen asp đƣợc sử dụng để cải biến và biểu hiện trong nấm
men P. Pastoris