Trƣớc khi cải biến gen, trình tự gen ban đầu (A. oryzae asp) đƣợc phân tích sơ bộ bằng công cụ phân tích mã bộ ba hiếm (Rare codon analysis tool, Genscript). Công cụ này cho phép đánh giá khả năng biểu hiện của gen ngoại lai A. oryzae asp trong chủng chủ P. pastoris và S. cerevisiae thông qua chỉ số codon phù hợp (CAI – codon adaptation index). Ngoài ra, việc phân tích gen bằng công cụ này còn cung
25
cấp thêm bảng phân bố các codon của gen ứng với tần suất sử dụng của nó trong chủng chủ, đề ra những hƣớng ban đầu để cải biến gen [63]. Công cụ Graphical Codon Usage Analyzer cho phép tìm ra và thay thế các codon có tần suất sử dụng rất thấp trong chủng chủ (là nguyên nhân chính làm giảm khả năng biểu hiện của gen ngoại lai trong chủng chủ). Công cụ Blast của NCBI đƣợc sử dụng để so sánh trình tự các gen cũng nhƣ protein mà gen mã hóa trƣớc và sau cải biến [61]. Gen sau cải biến sơ bộ (asp1) đƣợc thiết kế có thêm trình tự của enzyme hạn chế tạo thuận tiện cho các thao tác sinh học phân tử trong tạo dòng cũng nhƣ trong biểu hiện enzyme sau này. Các trình tự tín hiệu tiết không mong muốn có trong gen có thể đƣợc phát hiện bằng công cụ Predisi [58].
2.2.2. Phƣơng pháp PCR
Nguyên lý phản ứng PCR
PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase cùng với sự có mặt của mồi và nguyên liệu dNTPs. Sự khuếch đại này đƣợc thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (25-40 lần) gồm đun nóng khoảng 95oC (tháo xoắn chuỗi DNA), làm nguội xuống 37– 65oC (bắt cặp mồi với mạch đơn tƣơng ứng) và ủ ở khoảng 72oC (tổng hợp chuỗi). Nhờ vậy, 1 đoạn mạch kép DNA, sau n chu kỳ phản ứng, sẽ thành 2n mạch DNA kép [56].
Các bước thực hiện
Trƣớc khi tiến hành phản ứng PCR, các thành phần của phản ứng PCR cần phải đặt lên đá cho tan dần hoàn toàn. Các bƣớc làm phản ứng PCR đều phải tiến hành trên đá. Mẫu PCR tiến hành trong tổng thể tích cho mỗi mẫu phản ứng là 25 μl bao gồm các thành phần sau: - H2O: 8,7 µl - DNA khuôn: 1,0 µl - Dung dịch đệm 10X: 2,5 µl - Mồi xuôi 10 µM: 1 µl - Mồi ngƣợc 10 µM: 1 µl
26 - dNTP 2,5 mM: 2,5 µl - MgSO4 2,5 mM: 8 µl - Tap polymerase (5U/µl): 0,5 µl
- Gen asp1 đƣợc khuyếch đại theo chu trình nhiệt nhƣ sau: Bƣớc 1: 94oC 2 phút Bƣớc 2: 94 oC 30 giây Bƣớc 3: 55 oC 30 giây Bƣớc 4: 72 oC 1 phút 30 giây Bƣớc 5: 72 oC 10 phút Bƣớc 6: 4 oC vô cùng