Nguyên lý biến nạp sốc nhiệt
Tế bào E. coli khi đƣợc xử lý bằng các cation nhƣ calcium, magnesium,
manganese, rubidium hay hexamine cobalt sẽ bị thay đổi tính thấm của màng, do đó sẽ cho phép DNA đi vào tế bào vi khuẩn E. coli. Việc xử lý các cation cho phép làm trung hòa điện tích âm của màng ngoài tế bào, vốn dĩ bình thƣờng tích điện âm nên gây cản trở không cho phép DNA cũng tích điện tích âm đi xuyên qua lớp vỏ tế bào để đi vào bên trong tế bào. Tế bào sau khi bổ sung DNA đƣợc đặt trên đá để làm ổn định sự tƣơng tác giữa ion Ca2+ và các cấu trúc tích điện âm của màng DNA. Hỗn hợp này sau đó đƣợc đƣa vào bể ổn nhiệt 42oC trong một khoảng thời gian rất ngắn để làm thay đổi tính lƣu động của trạng thái bán tinh thể của màng tế bào, qua đó cho phép các phân tử DNA đi vào trong tế bào qua các kênh vận chuyển [56].
Các bước thực hiện
a. Quy trình tạo tế bào khả biến dùng cho biến nạp sốc nhiệt
Cấy ria chủng E. coli từ -80oC ra đĩa LB và ủ qua đêm ở 37o
C để chọn đƣợc khuẩn lạc rời. Lấy 1 khuẩn lạc cấy vào trong môi trƣờng LB lỏng, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37oC để làm tƣơi tế bào. Sang ngày thứ hai, pha loãng dịch nuôi cấy (100 – 200 lần) vào trong 200 ml môi trƣờng LB mới, lắc tiếp ở 37o
C trong 2 giờ để làm tƣơi tế bào rồi thu mẫu khi OD đạt đƣợc từ 0,2 đến 0,4. Mẫu lấy ra đặt trong hộp đá 1 giờ rồi chia ra các ống Falcon, ly tâm 3000 vòng/phút trong 5 phút, ở 4o
C. Thu tủa tế bào trong box. Tất cả các bƣớc tiếp theo đều phải làm trên đá.
Tủa tế bào đƣợc hòa lại bằng dung dịch CaCl2 0,1M cho tới thể tích tƣơng đƣơng ban đầu rồi để trong đá khoảng 10-15 phút. Sau đó mẫu đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Tủa tế bào đƣợc thu trong tủ cấy vô trùng và hòa lại vào dung dịch CaCl2 0,1M, để trên đá trong một giờ. Mẫu tiếp tục đƣợc ly tâm 3000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4oC. Hòa tan tế bào thật đều trong CaCl2 0,1M có chứa glycerol 10-20% rồi chia ra mỗi ống nhỏ ra các ống Eppendorf. Giữ tế bào khả biến
28
ở -80oC. Đồng thời, cấy trải tế bào khả biến ra đĩa LB và LBA (100 μg/ml), ủ ở 37oC qua đêm để kiểm tra.
b. Quy trình biến nạp sốc nhiệt
Lấy ống tế bào khả biến dành cho biến nạp sốc nhiệt từ tủ -80oC, để trên đá 30 phút để cho ống tế bào tan dần. Lấy một lƣợng mẫu DNA cần biến nạp phù hợp cho vào ống tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng để mẫu phân bố đều trong tế bào khả biến. Sau đó để mẫu trên đá 30 phút. Đƣa dung dịch trên vào bể ổn nhiệt 42oC trong 1 phút 30 giây rồi đặt nhanh mẫu lên trên đá trong 2 phút. Bổ sung 600 µl LB lỏng vào ống tế bào, lắc ở 37oC trong 45 phút đến 1 giờ. Tế bào đƣợc cấy trải trên đĩa LBA đặc (LB + Amp 100 µg/ml) ủ các đĩa ở 37oC qua đêm rồi quan sát kết quả biến nạp.