Các công trình nuôi trồng vi tảo được bắt đầu và cùng với sự phát triển của hoạt động nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên các nghiên cứu phân lập và lưu giữ giống tảo thuần chủng lại không nhiều.
Từ những năm 1970, Skeletonema costatum do Vũ Dũng phân lập và nhân giống thành công đã được trường Đại học Thuỷ sản thử nghiệm nuôi trồng tại các cơ sở sản xuất. Năm 1997 với dự án phát triển trai ngọc ở Bến Bèo, Hải Phòng, tảo
Chroomonas sp. được đưa vào nuôi thành công ở Trung tâm Quốc gia Hải sản Miền Bắc (trích theo [6]). Sau đó đã có thêm nhiều nghiên cứu về Skeletonema costatum. Năm 1991, Đỗ Văn Khương và Lê Viễn Chí đã phân lập và lưu giữ loài tảo
Skeletonema costatum ứng dụng làm thức ăn cho ấu trùng tôm he và đề xuất quy trình nuôi sinh khối một số loài tảo silic khác như: Chaetoceros gracilis, C. calcitrans phục vụ cho nghề sản xuất giống tôm he [10, 11]. Năm 1989, Trung tâm Nghiên cứu Thủy sản III đã phân lập được S. costatum tại vùng biển Nha Trang và nuôi đại trà làm thức ăn cho tôm sú đạt kết quả tốt [16].
Viện Nghiên cứu NTTS II đã sử dụng thành công một số loài vi tảo như: Tetraselmis chuii, Chlorella sp., Nannochloropsis oculata, Platymonas sp.,
Isochrysis galbana trong “qui trình nuôi nước xanh” để ương nuôi ấu trùng cá biển từ những năm 2000. Để phục vụ cho các đề tài, dự án sản xuất giống một số đối tượng
nuôi, Khoa NTTS - Trường Đại học Nha Trang cũng lưu giữ và nuôi thu sinh khối được nhiều loài tảo như: Tetraselmis sp., Nanochloropis oculata, Isochrysis gabana,…
làm thức ăn cho Artemia, luân trùng để nuôi ấu trùng cá chẽm [13].
Từ năm 2000 đến nay, Viện Nghiên cứu NTTS III đã lưu giữ và nuôi sinh khối thành công các loài tảo silic (Chaetoceros calcitrans, Chaetoceros sp., Skeletonema costatum, Navicula sp., Nitzschia sp.), tảo lục (Nanochloris sp., Chlorella sp., Tetraselmis sp.), tảo mắt (Nanochloris oculata), tảo vàng ánh (Isochrysis sp.) [9]. Đồng thời tiến hành thu thập, phân lập theo nhiều phương pháp (pha loãng, nuôi cấy trên môi trường thạch) và lưu giữ trong môi trường (TT3, f/2...) dạng lỏng, bán lỏng ở nhiệt độ (5 - 60C, 150C, 20 - 250C) để phân lập và lưu giữ lại được nhiều loài tảo nhập từ Trung Quốc, Đan Mạch, Úc, Philippines… như Tetraselmis suecica, Nannochloropsis atomus,
Chaetoceros calcitrans… và một số loài được thu thập ở biển Việt Nam như:
Chaetoceros muelleri, Skeletonema costatum, Nitzschia closterium, Navicula sp.…[9]. Năm 2009, Phạm Mỹ Dung đã phân lập được hai loài tảo Chaetoceros muelleri và
Tetraselmis sp. từ vùng biển Nam Định và Cát Bà (Hải Phòng) bằng phương pháp pha loãng, sử dụng micropipet và cấy trên môi trường thạch [6]. Tiếp theo đó năm 2011, Trần Thị Tuyết Lan đã phân lập được hai loài Chaetocerosglacilis và Tetraselmis chuii
thu bằng lưới vợt phù du ở vùng biển Hải Phòng và Khánh Hòa bằng phương pháp pha loãng và cấy trên môi trường thạch [12]. Sau các công trình phân lập và lưu giữ giống tảo, một số tác giả đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố như: độ mặn, ánh sáng, môi trường dinh dưỡng, mật độ ban đầu… lên sinh trưởng của tảo [7, 15].
Có thể nói rằng cho tới nay, nhiều loài tảo đã được nghiên cứu phân lập, lưu giữ, thử nghiệm nuôi sinh khối làm thức ăn cho động vật nổi (Artemia, luân trùng,…) và các đối tượng thủy sản (điệp quạt, hàu, tu hài, tôm sú, cá chẽm,…) với nhiều công trình được công bố nhưng rất ít công trình nghiên cứu sâu đến phương pháp phân lập các loài tảo.
Vi tảo có vai trò hết sức quan trọng trong các trại sản xuất giống thương mại đối tượng thủy sản như: cá, giáp xác, động vật thân mềm. Đặc biệt tảo là thức ăn không thể thay thế được trong sản xuất giống động vật hai mảnh vỏ. Sử dụng vi tảo đã mang lại thành công đáng kể cho việc nghiên cứu sản xuất giống cua, cá biển, sò huyết, ốc hương, nghêu, tu hài, hải sâm…. Vi tảo đã được sử dụng trong sản xuất
giống hải sản tại Viện Nghiên cứu NTTS III trong nhiều năm qua và đã làm tăng tỷ lệ sống lên 3,95% của vẹm xanh (Perna viridis) ở giai đoạn ấu trùng chữ D đến con giống 3 - 5 mm khi sử dụng hỗn hợp tảo tươi N. oculata, Chaetoceros sp., Isochrysis galbana, Platymonas sp., ốc hương (Babylonia areolata) giai đoạn Verliger lên 60 - 65% với hỗn hợp N. oculata, Chaetoceros sp., Isochrysisgalbana, Platymonas kết hợp với thức ăn tổng hợp; sò huyết (Anadara granosa) ở giai đoạn ấu trùng nổi lên 70% với N. oculata, Chaetoeros sp., Isochrysis sp., Platymonas sp.); tu hài (Lutraria rhynchaena) ấu trùng nổi tới con giống 7 - 10 mm lên 1,42% với N. oculata,
Chaetoeros, Platymonas so với thức ăn tổng hợp Lansy, Fripak lên 0,34%; điệp quạt (Chlamys nobilis) giai đoạn ấu trùng D tới spat lên 7,5 - 9,5% với hỗn hợp Chaetoeros muelleri, Platymonas, Isochrysis galbana [17]. Bên cạnh đó, tại Viện Nghiên cứu Hải sản Hải Phòng cũng đã thành công trong việc sử dụng một số loài tảo đơn bào như:
Chlamidomonas sp., Chaetoceros calcitran, Dunaliella sp. trong ương nuôi ấu trùng trai ngọc [2, 3].
Hiện nay, ở nước ta tuy việc sản xuất giống các đối tượng thuỷ sản có giá trị kinh tế phát triển manh mẽ, nhưng để chủ động sản xuất thức ăn tươi sống cho các giai đoạn ấu trùng khác nhau còn gặp nhiều khó khăn. Hầu hết các cơ sở sản xuất giống đều bị động và phải dùng thức ăn thay thế như thức ăn chế biến, bột đậu nành, tảo khô… Nguồn giống và sinh khối tảo còn phụ thuộc vào thu vớt tự nhiên nên không thuần nhất, khó lưu giữ. Nguyên nhân là do chưa có phương pháp phân lập tối ưu, nuôi giữ thuần chủng trong điều kiện phòng thí nghiệm cũng như chưa có quy trình công nghệ nuôi thích hợp đảm bảo nhân nhanh sinh khối vi tảo nhất là giống ban đầu. Việc ứng dụng các phương pháp phân lập, lưu giữ giống tảo đang được sử dụng ở nhiều nước trên thế giới vào công nghệ phân lập, lưu giữ cũng như nuôi đại trà vi tảo ở Việt Nam còn chưa phổ biến. Vì thế, các loài tảo dùng làm thức ăn cho đối tượng thủy sản thường được nhập giống thuần từ nước ngoài như: Chaetoceros sp., Chlorella sp.,
Platymonas sp., Nannochloropsis oculata, Chaetoceros muelleri, Isochrysis galbana… và lưu giữ trong phòng thí nghiệm với chi phí cao, chỉ có một ít loài được phân lập từ biển Việt Nam như: Skeletonema costatum, Nitzschia closterium, Navicula
sp.… [9]. Ngoài ra một số loài tảo đã bị nhiễm tạp hoặc đang thoái hóa. Do các chủng giống tảo có nguồn gốc nhập ngoại, nên chưa có phương pháp lưu giữ giống thuần
cũng như quy trình công nghệ nuôi trồng chúng chưa thích hợp với điều kiện khí hậu của Việt Nam, nên hiệu quả đem lại chưa cao, sinh khối đạt được thấp, bị tạp nhiễm nhiều, nguồn giống sơ cấp không chủ động được, đặc biệt là không có được các chủng giống phân lập được từ Việt Nam nên tính chống chịu với điều kiện như: nhiệt độ, độ mặn cao là rất thấp. Vì vậy việc phân lập vi tảo hiện có mặt ở các vùng biển Việt Nam là hết sức cần thiết để có thể chủ động nguồn giống cung cấp cho các trại NTTS, phân lập được các loài vi tảo có khả năng thích nghi tốt với điều kiện khí hậu của Việt Nam. Đặc biệt phân lập một số vi tảo có giá trị dinh dưỡng sử dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ tại địa phương là hết sức quan trọng để tối ưu hóa sản xuất thương mại.
CHƯƠNG II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Thời gian nghiên cứu
Từ 16/6/2013 - 16/7/2014
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng tảo và trại sản xuất ấu trùng, phòng Sinh học Thực nghiệm, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III.
2.1.3. Đối tượng nghiên cứu
- Vi tảo có trong nước biển tự nhiên từ vùng biển Nha Trang. - Ấu trùng hàu Thái Bình Dương Crassostrea gigas
2.2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Hình 2. 2. Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu
Phân lập và nuôi sinh khối một số loài vi tảo từ biển Nha Trang sử dụng cho động vật thân mềm hai mảnh vỏ”
Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo từ
vùng biển Nha Trang
Lưu giữ và nuôi sinh khối một số loài tiềm năng
Thử nghiệm làm thức ăn cho ấu trùng hàu
Thái Bình Dương.
Kết luận và đề xuất ý kiến Tạo giống thuần và xác định
tên khoa học
Xác định điều kiện lưu giữ và nuôi sinh
khối phù hợp
Xác định mức độ phù hợp làm thức ăn của
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tuyển chọn, phân lập và định tên khoa học một số vi tảo từ vùng biển Nha Trang bằng phương pháp pha loãng và phương pháp cấy trên đĩa agar. Trang bằng phương pháp pha loãng và phương pháp cấy trên đĩa agar.
Phân lập tảo
Hình 2. 3. Sơ đồ khối phân lập vi tảo
Nước biển được bơm trực tiếp từ tự nhiên vào 2 bể có thể tích 1 m3/bể sau đó làm giàu với môi trường f/2 để tảo phát triển làm nguồn phân lập: 1 bể bổ sung silic và 1 bể không bổ sung silic. Sau vài ngày tảo phát triển với một vài loài tảo khuê và tảo roi. Mẫu được lọc qua lưới 200 µm để loại bỏ động vật phù du, các hạt lớn và sau đó được dùng làm nguồn tảo phân lập. Tảo được phân lập theo phương pháp của Andersen (2005) [43]
Phân lập trên môi trường thạch
Chuẩn bị môi trường thạch: Bổ sung agar với nồng độ 1,5% vào nước biển có độ mặn 30‰, bổ sung môi trường f/2, chia làm 2 bình, một bình có silic, một bình không có silic sau đó hỗn hợp này được khử trùng ở điều kiện nhiệt độ 1210C trong 30 phút và 1atm. Sau khi khử trùng để nguội 40 - 500C, hỗn hợp trên được đổ vào các
Nước biển
Nuôi sinh khối với môi trường F/2 có silic
Nuôi sinh khối với môi trường F/2 ko có silic
Cấy trên thạch Pha loãng
đĩa petri đã khử trùng, để nguội và đậy nắp ở điều kiện phòng 1 - 2 ngày sau đó mang ra cấy phân lập (cần loại bỏ những đĩa thạch có thể bị nhiễm trong quá trình thao tác).
- Khi thạch đông, nguội thì tiến hành cấy tảo. Dùng pipet tiệt trùng lấy 0,1 mL hỗn hợp tảo đã làm giàu vào đĩa agar. Dùng que cấy tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ, để nguội rồi dùng que cấy dàn tảo lên agar theo các vệt sọc.
- Băng mép đĩa petri bằng parafin rồi để trong phòng với nhiệt độ khoảng 24 - 250C. - Để các đĩa thạch dưới điều kiện chiếu ánh sáng đèn neon khoảng 300 lux, nhiệt độ 250C. Sau 2 tuần, tiến hành kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (thời gian cần thiết cho tảo mọc trên thạch thường là 2 đến 4 tuần sau khi cấy) để phát hiện các quần lạc tảo. Nếu phát hiện thấy tảo đã mọc, dùng kính lúp chọn ra các khuẩn lạc riêng rẽ và tiến hành cấy chuyển sang các đĩa thạch khác nhằm tạo các dòng tế bào thuần. Lặp lại quy trình này cho đến khi thu được dòng tế bào thuần. Dùng que cấy lấy các quần lạc tảo đem soi dưới kính hiển vi để xác định quần lạc tảo. Các quần lạc tảo được chuyển vào ống nghiệm đã có sẵn 9mL nước nuôi tảo bằng que cấy. Sau khoảng 3 - 7 ngày, tảo trong ống nghiệm phát triển thì đưa tảo ra nhân sinh khối.
* Phân lập theo phương pháp pha loãng
Phương pháp phân lập này dựa vào các mức độ pha loãng tối đa tại đó dung dịch chỉ chứa một tế bào (một cơ thể) và được nuôi trong ống nghiệm. Phương pháp nêu trên áp dụng hiệu quả cho việc phân lập các vi tảo chiếm lượng lớn trong mẫu. Nếu số lượng tế bào xấp xỉ trong mẫu cần phân lập mà không biết và không thể tính toán được thì tiến hành pha loãng liên tục mẫu theo cấp 10-1, 10-2 tới 10-10 sau khoảng 7 đến 10 lần pha loãng liên tục tùy thuộc vào nồng độ và trạng thái mẫu thì cũng có thể thu được tảo đơn loài.
Các bước thực hiện:
- Pha nước biển với môi trường f/2, chia ra 2 mẫu, 1 mẫu có silic và 1 mẫu không có silic. Hấp tiệt trùng dung dịch ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút.
- Chuẩn bị các ống nghiệm 10 mL, đánh số thứ tự từ 100, 10-1, 10-2,..., 10-10. Hấp tiệt trùng ống nghiệm nhiệt độ 1210C trong 30 phút. Đổ 9 mL nước biển vào mỗi ống nghiệm trừ ống 100. Sử dụng 50 ống nghiệm với 5 lần lặp lại để phân lập mẫu tảo làm giàu với môi trường f/2 có silic với độ pha loãng từ 100, 10-1, 10-2,..., 10-10. Tương tự dùng 50 ống nghiệm để phân lập mẫu tảo làm giàu với môi trường f/2 không silic.
- Hút 10mL dịch mẫu tảo làm giàu vào ống 100 sau đó hút 1mL dịch tảo này sang ống 10-1, thay đầu pipette và hút 1mL dịch tảo từ ống 10-1 sang ống 10-2, lại thay
đầu pipette và hút 1mL dịch tảo từ ống 10-2 sang ống 10-3, cứ tiếp tục quy trình như vậy cho đến 10-10.
- Các ống chứa mẫu pha loãng được nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu 300 lux trong phòng nhiệt độ 270C và thường xuyên kiểm tra tảo phát triển.
Sau 2 - 4 tuần kiểm tra tảo dưới kính hiển vi bằng cách lấy mẫu từ mỗi ống nghiệm. Loài đơn có thể phát triển ở ống nghiệm có độ pha loãng cao từ 10-6 tới 10-10. Nếu ống nghiệm chứa nhiều loài tảo tiếp tục pha loãng để có thể thu được tảo đơn loài.
Hình 2. 4. Sơ đồ pha loãng tảo ở các nồng độ khác nhau
Định tên khoa học vi tảo
Chụp ảnh hình thái tế bào vi tảo trên kính hiển vi quang học. Tảo được xác định theo miêu tả của Camelo R. Tomas (1997) [47].
Gửi mẫu tảo sang Đại học Ghent, Bỉ để xác định chính xác tên vi tảo bằng phương pháp giải trình nucleotit của các gen.
2.3.2. Lưu giữ và nuôi sinh khối hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp.
2.3.2.1. Lưu giữ hai loài tảo Isochrysis galbana và Thalassiosira sp.
Tảo giống được lưu giữ trên môi trường lỏng đặt ở phòng thí nghiệm. Ưu điểm của phương pháp này là dễ quan sát mẫu, thuận lợi cho việc nhân nhanh sinh khối trong một thời gian ngắn, dễ tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam. Tuy nhiên, phương pháp này còn một số hạn chế như thời gian lưu giữ mẫu ngắn
(từ 3 - 4 tuần), tuỳ thuộc vào chu kỳ sinh trưởng của từng chủng, chiếm diện tích trên giàn nuôi và khả năng lây nhiễm giữa các mẫu là rất lớn do phải cấy chuyển nhiều lần cũng như là tốn sức lực của người quản lý chủng giống. Các mẫu vi tảo sẽ được nuôi trên môi trường lỏng phù hợp đến khi tế bào vi tảo ở vào pha sinh trưởng theo hàm số mũ (ở pha logarit) sẽ tiến hành lấy mẫu và lưu giữ giống.
Hút 5 mL môi trường lỏng vào từng ống nghiệm, sau đó bổ sung lượng mẫu với tỉ lệ là 70: 30 theo thể tích (v/v). Tất cả các công đoạn trên đều thao tác trong điều kiện vô trùng, tránh bị nhiễm khuẩn. Các mẫu vi tảo quang tự dưỡng sẽ được giữ trên 3 ống nghiệm. Các ống nghiệm được dán nhãn ghi rõ tên và ngày cấy chuyển. Sau đó, chúng sẽ được nuôi trong điều kiện ánh sáng yếu (300 lux) và nhiệt độ thấp (20 - 240C), 2 - 3 ngày sau khi cấy chuyển cần phải theo dõi và kiểm tra mẫu. Lập sổ theo dõi sau khi cấy chuyển và ghi chép lại tình trạng phát triển của mẫu tảo, thời gian cấy chuyển, số lượng mẫu… Tất cả chủng giống phải được giữ ở cả 3 đợt cấy chuyển liên tiếp (3 thế hệ) để tránh mất giống.
Thí nghiệm 1. Bố trí thí nghiệm chọn thời gian lưu giữ phù hợp thể hiện qua Hình 2.4
Hình 2. 5. Sơ đố bố trí thí nghiệm xác định thời gian lưu giữ thích hợp.
Điều kiện lưu giữ: Hai loài vi tảo được giữ trong ống nghiệm ở độ mặn 25‰, môi trưởng f/2, cường độ ánh sáng 300 lux ở môi trường lỏng, nhiệt độ 23 - 240C.