Nhân cụm chồi là một trong những giai đoạn tương đối quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro. Nếu môi trường nhân cụm càng tốt có nghĩa là hệ số nhân càng cao thì giá thành sản xuất sẽ càng thấp, thời gian nhân nhanh cây càng ngắn dẫn đến
khả năng nhân cụm của cây Kiết Tường trong môi trường MS có bổ sung các chất ĐHST từ đó nhằm mục đích tìm ra môi trường tối ưu cho quá trình nhân cụm.
Theo nghiên cứu của Lê Thị Kim Hiếu [2] thì các mô lá hoa Kiết Tường đều cho khả năng tái sinh chồi rất cao với hai nhóm auxin kết hợp cytokinin. Vì vậy trong thí
nghiệm này chúng tôi bổ sung NAA và BA với những nồng độ khác nhau cho quá trình nhân cụm cây Kiết Tường.
Bảng 3.5. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ chồi của cây Kiết Tường trong môi trường MS có bổ sung BA kết hợp với NAA
Nghiệm thức NAA (ppm) BA (ppm) Hệ số nhân
chồi ĐC 0 0 1,05 K1 0,05 0,05 1,48 K2 0,05 0,10 1,76 K3 0,05 0,30 5,00 K4 0,10 0,05 5,91 K5 0,10 0,10 5,57 K6 0,10 0,3 5,24 K7 0,30 0,05 2,91 K8 0,30 0,10 1,86 K9 0,30 0,30 1,38 LSD0,05 1,47
Kết quả nhận được ở Bảng 3.5 và Hình 3.2 cho thấy nghiệm thức từ K3 đến K7 đều
cho sự khác biệt có ý nghĩa đối với hệ số nhân chồi. Trong đó, hệ số nhân tăng dần từ
nghiệm thức K3 đến nghiệm thức K4 và sau đó giảm đến nghiệm thức K7. Cụ thể là ở
nghiệm thức K4 bổ sung BA với nồng độ là 0,05ppm kết hợp NAA với nồng độ
0,1ppm cho kết quả hệ số nhân chồi cao nhất là 5,91. Trong khi đó, theo nghiên cứu
của Thái Thị Thu Thảo khi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng nhân chồi cây Kiết Tường sử dụng riêng rẽ BA ở nồng độ 0,1ppm cho kết quả về hệ số nhân chồi thấp hơn
chỉ đạt 5,33 [9], hoặc sử dụng NAA ở nồng độ 0,1ppm cũng chỉ cho kết quả về hệ số
nhân chồi là 1,83 hoàn toàn thấp hơn khi sử dụng kết hợp hai chất này.
Ngoài ra, chồi tạo thành có lá tương đối khỏe, to, chồi cao và các chồi trong cùng một cụm có sự phát triển tương đối đồng đều.
Hình 3.2. Chồi tạo được từ chồi mẹ ban đầu 3.2.2. Khảo sát quá trình tạo chồi từ lá
Theo một số nghiên cứu trước đây như nghiên cứu của Nguyễn Sĩ Tuấn và cộng sự
về sự tái sinh chồi và rễ trực tiếp từ mô lá cây Kiết Tường [9] cho kết quả tái sinh chồi
tốt nhất từ mô lá trên môi trường MS có bổ sung BA và môi trường tái sinh cây từ lá
trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Oanh [8] là ½ MS có bổ sung 2 nhóm BA và IBA. Dựa trên những kết quả như vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát quá
trình tạo chồi từ lá dưới ảnh hưởng của BA.
Bảng 3.6. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ lá của cây Kiết Tường trong môi trường MS có bổ sung BA
Nghiệm thức BA(ppm) Số mẫu tạo chồi (%) Số chồi/ mẫu ĐC 0 0 0 B1 0,5 80 1,83 B2 1,0 100 2,83 B3 1,5 80 1,23 B4 2,0 70 1,10 LSD0,05 0,33
Từ kết quả Bảng 3.6 cho thấy rằng hoạt chất BA khi bổ sung vào môi trường nuôi
cấy có khả năng kích thích sự hình thành chồi từ các mô lá cây Kiết Tường với tần số 70 đến 100%. Trong đó, nghiệm thức tối ưu là B2 có bổ sung BA với hàm lượng
1,0ppm và với điều kiện này tần suất tạo chồi là 100%. Số chồi trung bình tạo được từ
mỗi mẫu là 2,83 chồi. Tuy nhiên hình thái chồi tạo được từ mẫu cấy mô lá không tốt so
với các chồi hình thành từ chồi mẹ ban đầu. Cụ thể ở đây là các chồi tạo ra từ mô lá
Hình 3.3. Chồi tạo được từ lá
Như vậy, cây Kiết Tường cũng có thể tạo chồi từ các mô lá bằng cách bổ sung hoạt (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chất BA với nồng độ là 1,0ppm nhưng chất lượng chồi tạo được sẽ không tốt so với các
chồi hình thành từ mẫu cấy ban đầu là chồi mẹ.
3.2.3. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh cây Kiết Tường
Auxin là nhóm chất ĐHST được sử dụng thường xuyên trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Auxin khi bổ sung môi trường nuôi cấy sẽ kích thích tạo rễ [2].
Theo nghiên cứu của Thái Thị Thu Thảo, khi bổ sung IBA và NAA thì chiều dài cây, chiều dài rễ và sinh khối cây được cải thiện rõ rệt so với đối chứng [5].
Trong khi đó, giberillin là chất ĐHST được biết đến như là hoạt chất kéo dài đốt
thân [2].
Theo thí nghiệm của Tuấn và cộng sự khi bổ sung IBA và GA3 thì chồi tái sinh từ
mô lá cây Kiết Tường có độ phân đốt rõ rệt.
Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành thí nghiệm khảo sát khả năng tái sinh cây Kiết Tường dưới ảnh hưởng của NAA, IBA và GA3 kết hợp với nhau.
Bảng 3.7. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh trong môi trường MS có bổ sung NAA, IBA và GA3
Nghiệm thức GA3 IBA NAA
Chiều cao cây (cm) Chiều dài rễ (cm) Sinh khối tươi (g/cây) ĐC 0 0 0 1,0 0,1 0,05 TS1 0,01 3,7 0,7 0,22 TS2 0,03 4,4 1,2 0,48 TS3 0,5 0,05 4,3 1,2 0,70 TS4 0,01 3,9 0,9 1,02 TS5 0,03 4,3 0,9 1,10 TS6 0,1 1,0 0,05 4,1 0,8 1,26 LSD0,05 0,83 0,38 0,55
Dựa trên kết quả nhận được từ Bảng 3.7 cùng với sự quan sát về hình thái cây non, chúng tôi nhận thấy rằng cây non được tạo thành từ nghiệm thức có bổ sung 0,01 – 0,05ppm NAA kết hợp 1,0ppm IBA và 1,0ppm GA3 là tốt nhất.
Theo kinh nghiệm ứng dụng phương pháp in vitro trong nhân giống cây Kiết Tường
của một số người trồng hoa thì cây non Kiết Tường có khả năng sống tốt sau khi ra vườn ươm với chiều cao cây khoảng 3-4cm, rễ cây non có chiều dài khoảng 0,8- 1,5cm.
Hình 3.4. Cây tái sinh từ môi trường MS bổ sung kết
hợp NAA, IBA và GA3
3.3. Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ chồi
3.3.1. Khảo sát ảnh hưỏng của thời gian đông tụ hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết T ường
Bảng 3.8. Khảo sát thời gian lưu giữ của hạt nhân tạo trong dung dịch CaCl2
Nghiệm thức Chiều cao cây
(cm)
Chiều dài rễ
(cm)
Sinh khối tươi
(g/1cây) 30 phút 3,8±0,07 1,2±0,12 0,19±0,09 40 phút 4,3±0,05 1,3±0,03 0,23±0,11 Thời gian lưu trong dung dịch CaCl2 50 phút 3,6±0,02 1,1±0,3 0,14±0,15
Thời gian lưu giữ hạt nhân tạo trong dung dịch CaCl2 ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây. Thời gian lưu giữ hạt càng lâu, khả năng sinh trưởng và phát triển của cây càng tốt. Tuy nhiên nếu giữ hạt quá lâu trong dung dịch
CaCl2 thì cây có thể sinh trưởng và phát triển chậm lại. Kết quả Bảng 3.8 cho thấy độ tăng trưởng của cây tăng khi tăng thời gian lưu hạt trong dung dịch CaCl2 từ 30 phút đến 40 phút. Tuy nhiên cây có hiện tượng phát triển chậm lại khi tăng thời gian lưu hạt đến 50 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Bảng 3.9. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên khả năng tạo hạt nhân tạo
Nghiệm thức Chiều cao cây
(cm)
Chiều dài rễ
(cm)
Sinh khối tươi
(g/1cây)
E1 0 0 0
E2 4,0±0,32 1,3±0,03 0,25±0,05
Kết quả Bảng 3.9 cho thấy nghiệm thức E1 với dung dịch CaCl2 ở nồng độ 25mM không có khả năng tạo hạt nhân tạo. Hạt tạo thành bị vỡ ngay trong khi khuấy dẫn đến
chồi không được bọc trong lớp vỏ hạt. Điều này có thể giải thích là vì nồng độ CaCl2
quá thấp làm cho lực liên kết giữa hạt alginate với ion Ca2+ yếu nên mạng luới gel chưa được hình thành.
Trong khi đó, ở nghiệm thức E2 và E3 tương ứng với dung dịch CaCl2 ở nồng độ
50mM và 75mM, có khả năng tạo hạt nhân tạo và phát triển thành cây.
Cụ thể là ở nghiệm thức E2 với dung dịch CaCl2 ở nồng độ 50mM, cây sinh trưởng
phát triển tốt nhất. Tất cả các thông số như chiều cao cây, chiều dài rễ và sinh khối tươi đều tỏ ra vượt trội hơn so với nghiệm thức E3. Như vậy hạt alginate tạo thành trong dung dịch CaCl2 50mM là thích hợp nhất cho việc tạo hạt nhân tạo cây Kiết Tường.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường chồi cây Kiết Tường
Từ kết quả Bảng 3.10, Biểu đồ 3.2 và Hình 3.6 cho thấy alginate có khả năng kích
thích sự sinh trưởng và phát triển của cây. Trong đó ở nghiệm thức D1 với nồng độ
alginate 3%, cây tăng trưởng và phát triển tốt. Trong đó chiều dài rễ và sinh khối tươi
cho kết quả khác biệt có ý nghĩa SVĐC. Tuy nhiên về chiều cao cây thì không có ý nghĩa nhiều về mặt thống kê. Cụ thể là:
Chiều dài rễ cao hơn khoảng 80%SVĐC.
Sinh khối tươi cao hơn khoảng 10%SVĐC.
Trong khi đó nghiệm thức ở nghiệm thức D2,tất cả các thông số như chiều
cao cây, chiều dài rễ và sinh khối tươi đều khác biệt có ý nghĩa SVĐC.
Cụ thể là:
Chiều cao cây ở nồng độ alginate 4% cao hơn khoảng 75% SVĐC.
Chiều dài rễ ở nồng độ alginate 4% cao hơn khoảng 100% SVĐC.
Sinh khối tươi ở nồng độ alginate 4% cao hơn khoảng 100% SVĐC. Như vậy nồng độ alginate 4% là thích hợp nhất để tạo hạt nhân tạo câ y Kiết Tường. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.10. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Nghiệm thức Chiều cao cây
(cm)
Chiều dài rễ
(cm)
Sinh khối tươi
(g/1cây) ĐC 2,5 0,6 0,17 D1 2,8 1,2 0,18 D2 4,0 1,3 0,22 LSD0,05 0,5 0,25 0,01 `
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ alginate lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
0 50 100 150 200 250 ĐC D1 D2 Nồng độ Alginate, %
Chiều cao cây
Chiều dài rễ
Sinh khối tươi
Đ ộ tă ng t r ư ởng , %
Hình 3.6. Cây tạo thành từ alginate 3% và algiante 4%
3.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate 4% kết hợp alginate chiếu xạ (300kGy) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường (300kGy) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Bảng 3.11. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate chiếu xạ lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Nghiệm thức Chiều cao cây
(cm)
Chiều dài rễ
(cm)
Sinh khối tươi
(g/1cây) ĐC 4,0 1,4 0,191 KA1 4,3 1,6 0,212 KA2 4,3 1,7 0,218 KA3 4,2 1,5 0,207 KA4 4,2 1,5 0,206 LSD0,05 0,11 0,11 0,01
Alg 4% Alg 3% Đối
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ alginate chiếu xạ lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Alginate chiếu xạ được xem là chất có tác dụng tăng trưởng cả sự phát triển của rễ,
thân và lá của nhiều loại cây trồng trong đó có cây Kiết Tường. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng phối hợp giữa alginate không chiếu xạ và alginate chiếu xạ nhằm gia tăng sự phát triển của hạt Kiết Tường sau khi chế tạo. Kết quả nhận được từ Bảng 3.11 và Đồ thị 3.3 cho thấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của cây khi bổ sung alginate
chiếu xạ đều thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa SVĐC mà cụ thể là chiều cao cây tăng lên đáng kể từ nghiệm thức KA1 đến KA2 và cao nhất ở nghiệm thức KA2 có nồng độ
alginate chiếu xạ bổ sung là 0,2% với chiều cao cây ghi nhận được là 4,3cm. Bên cạnh đó chiều dài rễ cũng cho kết quả cao vượt trội tại nghiệm thức này với con số là 1,7cm. Chiều cao cây và chiều dài rễ tăng mạnh dẫn đến kết quả sinh khối tươi cao nhất và cụ
thể là 0,218g/1cây.
Như vậy có thể thấy rằng khi bổ sung kết hợp alginate chiếu xạ (300kGy) trong hợp phần chế tạo hạn nhân tạo đã thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của hạt Kiết Tường sau khi chế tạo. Nồng độ phối hợp tốt nhất là 2,0%. 0 20 40 60 80 100 120 140 ĐC 0.1 0.2 0.5 1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ alginat chiếu xạ, %
Đ
ộ tăng tr
ư
ởng, %
Sinh khối tươi
Chiều cao cây
3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat 4% kết hợp chitosan chiếu xạ (0,1%) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường (0,1%) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Theo nhiều tài liệu nghiên cứu trước đây cho thấy chitosan chiếu xạ cũng có khả năng kích thích sinh trưởng thực vật giống như alginate chiếu xạ. Ngoài ra hoạt chất
này còn được gọi là các “elexitor” bởi vì chúng có khả năng kích thích thực vật tạo ra
các hoạt chất kháng khuẩn từ chính trong nội tại của chúng, các chất kháng vi sinh vật
này này được gọi là các “phytoalexin”. Từ những đặc tính quí giá của chitosan chiếu xạ
nói trên, trong thí nghiệm này chúng tôi mạnh dạn tiến hành khảo sát khả năng phối
hợp của chitosan chiếu xạ ở các liều chiếu khác nhau nhằm đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của hạt cây Kiết Tường chế tạo được.
Bảng 3.12. Khảo sát ảnh hưởng của chitosan chiếu xạ lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Nghiệm thức Chiều cao cây
(cm)
Chiều dài rễ
(cm)
Sinh khối tươi
(g/1cây)
ĐC 3,8 1,2 0,22
KC1 4,2 1,4 0,26
KC2 4,3 1,7 0,30
0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 100 1000 Liề u x ạ , kGy Độ tă ng trư ởng c ủa câ y, %
Sinh khối tươi Chiều cao Chiều dài rễ
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của chitosan chiếu xạ lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Kết quả nhận được từ Bảng 3.11 và Đồ thị 3.4 cho thấy, khả năng sinh trưởng và phát triển của cây khi bổ sung chitosan chiếu xạ cũng thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa SVĐC mà cụ thể là chiều cao cây tăng lên đáng kể từ nghiệm thức KC1 đến KC2 và cao nhất ở nghiệm thức KC2 với liều chiếu xạ 1000kGy với chỉ tiêu về chiều cao cây là 4,3cm. Bên cạnh đó chiều dài rễ cũng cho kết quả cao vượt trội tại nghiệm thức này và cụ thể là 1,7cm. Do sự gia tăng về chiều cao cây và chiều dài rễ nên dẫn đến sự gia tăng về sinh khối tươi là cao nhất (0,3g/1cây).
Như vậy có thể thấy rằng cũng giống như alginate chiếu xạ, khi bổ sung kết hợp chitosan chiếu xạ với liều xạ 1000kGy trong hợp phần chế tạo hạt nhân tạo đã có tác dụng thúc đẩy sự sinh trưởng và phát triển của hạt Kiết Tường sau khi chế tạo.
TÀI LIỆU THAM KHẢO (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
I. Tài liệu tham khảo tiếng việt
[1] Nguyễn Quốc Hiến (1999), Công nghệ bức xạ trong sinh học, Giáo trình giành cho sinh viên cao học, Đại học Đà lạt.
[2] Lê Thị Kim Hiếu (2006), Xây dựng hệ thống tái sinh cây hoa Kiết Tường (
Eustoma grandiflorum) theo hai con đường: phát sinh phôi vô tính và tái sinh
chồi trực tiếp từ nuôi cấy lá in vitro, Luận văn tốt nghiệp Đại học Mở Tp. HCM.
[3] Dương Công Kiên, Nuôi cấy mô thực vật, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM.
[4] Lê Quang Luân (1999), Nghiên cứu chế tạo oligoalginate bằng kĩ thuật bức xạ
và khảo sát hiệu ứng tăng trưởng trên một số đối tượng thực vật, Luận văn Thạc
sỹ Trường Đại học Đà Lạt.
[5] Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ Tế bào, NXB Đại
học Quốc gia Tp. HCM
[6] Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa
(2004), Chế biến rong biển, NXB Nông nghiệp.
[7] Nguyễn Thị Kim Oanh (2005), Tìm hiểu khả năng chế tạo hạt nhân tạo của cây
hoa Kiết Tường (Eustoma grandiflorum), Luận văn tốt nghiệp Đại học Mở, Tp.
HCM.
[8] Nguyễn Sỹ Tuấn, Hứa Mỹ Ngọc, Nguyễn Than Mai, Nguyễn Thành Hải và