1.4.1. Công nghệ bức xạ
1.4.1.1. Giới thiệu chung
Công nghệ bức xạ (CNBX) là sử dụng bức xạ làm nguồn năng lượng trong các quá
trình công nghiệp. CNBX hiện tại chủ yếu sử dụng nguồn bức xạ gamma (γ) phát ra
đồng vị Co-60 và bức xạ điện tử phát ra từ các máy gia tốc điện tử (electron beam – EB). Ứng dụng CNBX trong công nghiệp hiện nay đang được phát triển mạnh ở nhiều nước trên thế giới. Các thiết bị CNBX trong công nghiệp đã được thương mại hóa.
Tổng giá trị nguyên liệu chiếu xạ ước tính khoảng hơn 2 tỉ USD / năm và hàng năm gia
tăng với tốc độ khoảng 15-20 %. Theo số liệu năm 1996 toàn thế giới có khoảng 180 nguồn chiếu xạ gamma Co-60 và 800 máy gia tốc điện từ hoạt động phục vụ cho mục đích ứng dụng công nghiệp trong đó bao gồm ứng dung trong lĩnh vực sinh học.
1.4.1.2. Các ứng dụng
a. Các ứng dụng qui mô công nghiệp bức xạ
Xử lý sơn phủ bề mặt gỗ, kim loại và các loại vật liệu khác.
Lưu hóa cao su xản suất vỏ lớp xe.
Khâu mạch vật liệu cách điện.
Khử trùng dụng cụ y tế.
b. Các quá trình đang nghiên cứu phát triển (được ứng dụng ở mức độ nhất định)
Chiếu xạ thực phẩm, khử trùng mĩ phẩm và bào bì cho thực phẩm.
Chiếu xạ nước thải.
Biến tính ghép, khâu mạch chế tạo vật liệu tổng hợp sinh học và vật liệu
có hoạt tính sinh học, chế phẩm dược phẩm, hoocmon thải chậm.
Lưu hóa bức xạ lastic cao su thiên nhiên.
Chiếu xạ bất dục côn trùng, kích thích đột biến.
Biến tính gia tăng chất lượng vải, da thuộc.
Xử lý polymer tự nhiên làm chất tăng trưởng và bảo vệ thực vật.
1.4.1.3. Một số ưu điểm của công nghệ bức xạ
Tiết kiệm năng lượng, không gian và nguyên liệu.
Độ tin cậy cao (quá trình được kiểm tra hữu hiệu).
Sản phẩm có chất lượng cao, chế tạo sản phẩm mới.
Đáp ứng nhu cầu bảo vệ môi trường.
Hiệu quả kinh tế cao.
1.4.2. Ứng dụng công nghệ bức xạ trong nuôi cấy mô thực vật [4]
1.4.2.1. Oligosaccarit
Hiện nay năm loại hoocmon thực vật hay chất điều hòa sinh trưởng (growth
regulators) đã được xác định đó là auxin, absccisic acid, cytokinin, ethylen và
gybberelin. Năm 1985, sau hơn 10 năm nghiên cứu, hai giáo sư Peter Albersheim và
Alan G. Darwll, trường ĐH Colorado, Hoa Kì thông báo trên tạp chí ‘Science of
America’, 253, p.44 – 50 về chất điều hòa sinh trưởng thực vật mới gọi là ‘oligosaccarin’.
Oligosaccarin là oligosaccarit (polysaccarit mạch ngắn chứa chừng khoảng 2-20 monosaccharit), những phần phân chia (fragments) của thành tế bào, chúng được tiết ra
từ thành tế bào do enzyme. Thành tế bào chứa ít nhất 8 loại polysaccarit. Các loại
enzyme khác nhau sẽ tiết ra oligosaccarin khác nhau.
Oligosaccarit là nguồn cung cấp nguyên liệu cho con người và động vật.
chống lại các loại tác nhân gây bệnh. Ngoài ra, chúng còn được dùng trong bảo quản
thực phẩm.
Trong thực vật, các ‘Oligosaccarit’ chính là các chất truyền tín hiệu để đưa ra các thông điệp điều hòa, chức năng đó bao gồm điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển
và chống nhiễm bệnh cây trồng. Trong nhiều thí nghiệm khác về điều hòa sinh trưởng
nhiệt độ sử dụng oligosaccarit cũng đã chứng minh oligosaccarit thể hiện chức năng thúc đẩy tăng trưởng. Tham gia trong thời kì đầu thí nghiệm chứng minh tính chất thúc đấy tăng trưởng thực vật của oligosaccarit có nhà khoa học Việt Nam Kiều Trần Thanh
Vân làm việc ở laboratore du phytoron at Gift – sur Yvette, Pháp. Sau đó nhiều nghiên cứu được tiến hành một cách độc lập tại Nhật Bản và Việt Nam. Tại phòng công nghệ
bức xạ, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt cũng đã xác nhận và chứng minh rõ ràng thêm hiệu ứng này.
Ngoài khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng ở thực vật, oligosaccarit còn có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp nên kháng sinh trong mô của thực vật, hay nói cách
khác oligosaccarit đã tạo ra cho cây khả năng tự kháng lại một số nấm và vi khuẩn gây
bệnh bằng cách tự tạo ra kháng sinh thực vật gọi là phytoalexin. Tùy theo loại thực vật,
việc góp phần này gây ra hiệu quả khác nhau bao gồm tạo phytoalexin, tạo enzyme
endo β1-3 gluconaza, chitinaza, lyzozym để phân hủy thành tế bào nấm và vi khuẩn và
tăng cường tạo ra lighin mà lighin xem như màng chắn không cho nấm xâm nhập. Phytoalexin có thể được tạo thành dưới kích thích hóa học và vật lí nhất định.
Phytoalexin có khối lượng phân tử thấp, có tính độc không chuyên biệt, nhiều chất
trong chúng có bản chất là phenol. Phytoalexin là chất kháng sinh thực vật có thể hoạt động rộng mà đặc biệt nó không được tìm thấy trong mô của cây khỏe mạnh, nhưng nó được tổng hợp ở trong tế bào gần vị trí nhiễm bệnh như là phần phản ứng bảo vệ của
thực vật.
Người ta còn nhận thấy trong mô cây đậu tương khi bị xâm nhập bởi nấm
phytoptora megasfperma, heptosacrit glucan liên kết với nhau qua cầu nối β1-3 và β1-
6 đã thúc đẩy quá trình tổng hợp một chất phytoalexin là glyceollin và với hàm lượng
Vậy oligosaccarit là chất truyền tín hiệu làm cây tiết ra kháng sinh để tự bảo vệ khi
ta cho vào cây một hỗn hợp oligosaccarit chiết từ thành tế bào nấm thì tế bào cây có thể tổng hợp các enzym và các enzym này lại làm xúc tác cho quá trình sinh tổng hợp
kháng sinh. Từ đây hi vọng sẽ là một khởi điểm thú vị để phát triển về khoa học thực
vật cũng như cuộc cách mạng mới trong nông nghiệp sử dụng oligosaccarit làm chất
bảo về và điều hòa sinh trưởng thực vật.
1.4.2.2. Một số loại Oligosaccarit
Hiệu ứng sinh học cụ thể của từng loại oligosaccarit đối với thực vật là như thế nào thì vẫn còn là vấn đề rất mới mẻ.
Tuy nhiên cho đến nay các nhà nghiên cứu cũng đã xác định một cách sơ bộ hiệu ứng sinh học trên thực vật của một số loại oligosaccarit.
a. Oligochitosan.
Thí nghiệm in vitro trên vi khuẩn Escherichia coli của hai tác giả Matsuhashi và Kume (1996) chitosan có khối lượng phân tử ban đầu khoảng 7x105-106Dalton. Khi chiếu xạ dạng bột bằng bức xạ gamma với liều xạ 100kGy đã thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật là tốt nhất. Khi cho oligosaccarit vào môi trường nuôi cấy E. coli với nồng độ 3mg/l đã ức chế hoàn toàn vi khuẩn này trong 8 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC.
Nhiều công trình mới về vai trò của oligosaccarit trong tế bào đã cho thấy oligo
chitosan khi hiện diện trong mô thực vật nó sẽ kích thích tạo ra kháng sinh thực vật
(phytoalexin) giúp cây chống lại một số bệnh.
Công trình của Hadwigel (1980) và Loschke (1981) cho thấy oligochitosan có DP từ 6-11 có khả năng tạo ra kháng sinh trong mô của nhiều loại thực vật. Oligo chitosan
và các dẫn xuất của nó đã kích thích tạo phytoalexin trong vỏ đậu, trong tế bào đậu tương và cây ngô tây khi nuôi cấy chìm. Khi phân tích trên lá cà chua và lá khoai tây Waller – Simmon (1983) nhận thấy rằng oligochitosan còn sinh ra một chất ức chế Eproteinaza liên quan đến khả năng đáp ứng tự vệ của cây. Kendre (1984) đã nhận thấy
oligochitosan diệt một cách có hiệu quả các loại nấm bệnh trên cây đậu Hà lan, như
b. Oligopectin
Oligopectin hay còn gọi là oligogalaturonat cũng đã được nghiên cứu khá nhiều và cho thấy loại oligosaccarit này không chỉ có tác dụng thúc đẩy sự tăng trưởng và phát triển của cây trồng mà còn kích thích tạo ra các phytoalexin giống như oligochitosan.
Nhiều công trình nghiên cứu khác cũng cho thấy oligopectin chế tạo bằng ezym khi xử
lí phun lá cây trồng đã thể hiện hiệu ứng điều hòa sinh trưởng và phát triển cụ thể là làm cho lớn nhanh, hấp thụ chất dinh dưỡng nhanh hơn và làm tăng năng suất cây
trồng, đồng thời tạo cho cây khả năng ngăn chặn sự thâm nhập của các vi khuẩn, nấm
gây bệnh.
Từ những năm 1970 đã có nhiều nghiên cứu về chức năng của loại oligosaccarit này và đã cho thấy nhiều điều khá lý thú vị đó là oligogalatorunat hoạt động trong cây
giống như một phytohocmon nhưng hoạt tính lại phụ thuộc rất lớn vào khối lượng phân
tử của oligosaccarit. Tùy thuộc vào khối lượng phân tử mà oligopectin sẽ thể hiện chức năng hoạt động khác nhau đối với thực vật. Ví dụ như các oligopectin với DP từ 9-18 có tác dụng thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp etylen (Ridge và Osborne 1979), kích thích sự chín quả (Brecht và Huber 1988), sự hình thành và ra hoa (Marfa và cộng sự
1991) hoặc ức chế sự hoạt động của auxin (Branca và cộng sự 1988).
Nhìn chung các oligopectin có DP 4 đã thể hiện được hoạt tính điều hòa sinh
trưởng và bảo vệ đối với thực vật và hiệu ứng tốt nhất lại là các oligopectin DP trong khoảng từ 7-15, đặc biệt hoạt tính tạo phytoalexin thể hiện tối ưu khi xử lý thực vật với
các oligopectin DP từ 9-12.
Năm 1983, Walker – Simmons và cộng sự đã tiến hành khảo sát hiệu ứng sinh học
của oligochitosan, oligopectin chiết từ lá cà chua có Mw khoảng 5000Dalton với nồng độ xử lí là 2mg/ml đã có tác dụng làm tăng hàm lượng pisatin (Là một flavonoit
phytoalexin có tác dụng kháng bệnh trên cây) trong mô vỏ đậu Hà Lan nuôi cấy
in vitro, hàm lượng pisatin tăng dần theo thời gian và đạt cực đại sau 20 giờ xử lý (đối
với oligochitosan) và 24 giờ (đối với oligopectin).
Gần đây các thí nghiệm về hiệu ứng tăng trưởng thực vật của oligopectat chế tạo
giai đoạn cây con cho thấy khi xử lý với nồng độ 100ppm cho hiệu ứng nảy mầm cao hơn đối chứng 20%, ở giai đoạn sinh trưởng của cây con nồng độ thích hợp (60ppm) đã làm tăng chiều cao cây là 23,6 % và chiều dài rễ là 21,8% so với đối chứng.
c. Oligoalginat
Nếu như alginat được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghệ thực phẩm,
công nghệ dược phẩm và mĩ phẩm thì oligoalginat lại được ứng dụng rộng rãi hơn
nhiều, đặc biệt là trong lĩnh vực nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học.
Năm 1992, Akiyamo và cộng sự đã thông báo rằng oligoalginat có tính chất rất quí
là thúc đẩy tăng trưởng vi khuẩn Bifidobactiria loại vi khuẩn hiện diện trong đường
ruột cần cho quá trinh tiêu hóa ở người và động vật. Trong quá trình này tác giả cũng
cho thấy rằng alginate có khối lượng phân tử khoảng 49400Dalton khi bổ sung vào môi
trường nuôi cấy hàng loạt các vi khuẩn Bifidobacteria (B.aldolescentis M101-4, B.
bifidum A234-4, B. beeve I10-4 và B. longcion M101-2) thì hiệu ứng thúc đẩy tăng trưởng của chúng so với trước là không đáng kể, trong khi đó các oligoalginat có khối lượng phân tử trung bình khoảng 2000Dalton chế tạo từ alginat nói trên. Bằng phương
pháp thủy phân bởi enzym alginat lyaza với nồng độ từ 0.04-0.4 % lại có hiệu ứng cao hơn nhiều. Rất gần đây, Ariyo và các tác giả (1997) cũng đã nghiên cứu hiệu ứng của
oligoalginat lên sự gia tăng trong sản xuất penicilin ngoại bào của một số nấm
Penicilium chry sogenus (chủng P2 và BRRL 1941), kết quả cho thấy so với đối
chứng. Mặt khác nhiều công trình nghiên cứu tác dụng của oligoalginat cũng đã cho thấy oligoalginat còn có tác dụng như là tín hiệu hóa học để kích thích các quá trình sinh tổng hợp phytoalexin. Ngoài ra trong nuôi cấy mô oligoalginat có hiệu ứng thúc đẩy sinh trưởng và làm tăng sinh khối, gia tăng tốc độ phân bào ở một số loại tảo, thúc đẩy quá trình nảy mầm hạt giống và phát triển rễ, thân, lá của một số loài cây.
Như vậy oligoalginat là một loại oligosaccarit không chỉ thể hiện hiệu ứng tăng trưởng rất tốt đối với nhiều loại thực vật mà còn có khả năng tạo cho cây kháng bệnh. Điều đáng chú ý là oligoalginat có tính an toàn cao đối với người, gia súc, gia cầm và
môi trường. Do đó, việc chế tạo ra chế phẩm nông dược có nguồn gốc từ oligosaccarit nói chung và olgioalginat nói riêng là rất thiết thực cho nhu cầu sản xuất rau quả và nông phẩm sạch và phát triển môi trường bền vững ở nước ta và trên thế giới.
Chương 2
VẬT LIỆU
VÀ
2.1. Vật liệu
Giống hoa Kiết Tường dùng trong thí nghiệm là loại hoa màu trắng viền tím, cánh
kép rất được ưa chuộng trên thị trường hiện nay, có tên khoa học là Eustoma grandiflorum và tên thương mại là Lisianthus, Texas bluebell,… được cung cấp từ
công ty TNHH trang trại Lang biang. Vật liệu được tiến hành thí nghiệm là những mẫu
giống cây Kiết Tường in vitro được nuôi cấy sẵn trong phòng thí nghiệm.
2.1.1. Mẫu thí nghiệm
Mẫu lá: lấy từ cây Kiết Tường nuôi cấy trong chai thủy tinh khi cây cụm được
khoảng 10-12 lá. Mẫu lá được cắt thành hình chữ nhật kích thước 3x5mm và tạo vết thương bằng dao cấy.
Mẫu chồi: các chồi được tách từ cụm chồi với chiều cao mỗi chồi khoảng 0,5cm.
2.1.2. Môi trường nuôi cấy
Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige &
Skoog, 1962) [11] có bổ sung thêm 30g/l đường, 8g/l agar và một số chất điều hòa
sinh trưởng thực vật (ĐHST) như: 6-Benzylamin opurine (BA), Napthalen acetic acid (NAA), 2,4- Dichlorophenoxy acetic acid (2,4 D), Indol butyric acid (IBA). Độ pH
của môi trường được điều chình về khoảng 5,6-5,8 bằng dung dịch KOH 0,1N và HCl
0,1N. Môi trường được rót vào chai thủy tinh có dung tích 500ml với thể tích môi trường 50 ml/chai và sau đó đem hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ 121oC, 1atm trong 15 phút.
2.1.3. Điều kiện nuôi cấy
2.1.3.1. Địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài được tiến hành tại địa điểm: phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Tp. HCM,
405-407 đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận 10, Tp. HCM.
2.1.3.2. Phòng nuôi cấy
Phòng nuôi cấy tại phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Tp. HCM, 405 – 407
đường Cách Mạng Tháng Tám, Quận 10, Tp. HCM với các điều kiện được thiết lập
Thời gian chiếu sáng: 16 h/ngày.
Cường độ sáng: 2500-3000 lux.
Nhiệt độ phòng: 25 ± 2oC.
Độ ẩm: 60-70%.
2.2. Phương pháp thí nghiệm
2.2.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được
2.2.1.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được từ alginate không chiếu xạ chiếu xạ
a. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate đến quá trình tạo hạt
Thí nghiệm được tiến hành như sau:
Chuẩn bị:
100ml dung dịch CaCl2 có nồng độ 50mM trong bình thủy tinh 500ml.
4 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 2ml dung dịch Aginate ở các nồng độ 1%, 2%, 3% và 4%.
Dùng pipet hút 1-2ml dung dịch alginate ở nồng độ 1%. Nhỏ từ từ dung dịch
alginate vào dung dịch CaCl2 trên máy lắc từ để tạo hạt trong 5 đến10 phút. Hạt tạo thành được vớt ra để ráo và tiến hành đo đường kính bằng thước kẹp có độ chính xác 10-2mm. Sau đó hạt được cho vào đĩa petri và dùng nắp đậy kín đĩa. Hạt này được dùng
để khảo sát độ mất nước ở nhiệt độ phòng.
Tiến hành tương tự với dung dịch alignate ở các nồng độ 2%, 3% và 4% từ đó xác định nồng độ alginate tối ưu. Nồng độ alginate tối ưu sẽ được dùng làm vật liệu để tiến
hành thí nghiệm tiếp theo.
b. Khảo sát thời gian lưu của hạt alginate trong dung dịch CaCl2
Cách tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị:
100ml dung dịch CaCl2 50mM trong bình thủy tinh 500ml.
20ml dung dịch alginate 4% trong ống nghiệm.
Dùng pipet hút từ 1-2ml dung dịch alginate, nhỏ từ từ vào dung dịch CaCl2 trên máy lắc từ để tạo hạt trong 10 phút. Hạt được vớt ra để ráo và tiến hành đo đường kính bằng
thước kẹp có độ chính xác 10-2mm. Sau đó hạt được cho vào đĩa Petri, dùng nắp đậy
kín đĩa. Tiến hành tương tự với các khoảng thời gian cao hơn từ 20, 30 và 40 phút.
