hạt nhân tạo
2.2.2.1. Khảo sát quá trình tạo chồi từ các chồi mẹ ban đầu
Thí nghiệm được thực hiện trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm ba chai thủy
tinh và số mẫu cấy là 7mẫu/chai.
Mẫu cấy là những chồi được tách từ những đoạn thân có mang chồi bên của cây in vitro, chiều cao chồi từ 1-1,5cm.
Bảng 2.1. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ chồi của cây Kiết Tường trong môi trường MS có bổ sung BA kết hợp với NAA
Nghiệm thức NAA (ppm) BA (ppm) ĐC 0 0 K1 0,05 0,05 K2 0,05 0,10 K3 0,05 0,30 K4 0,10 0,05 K5 0,10 0,10 K6 0,10 0,3 K7 0,30 0,05 K8 0,30 0,10 K9 0,30 0,30
Số liệu được ghi nhận sau 5 tuần nuôi cấy gồm những chỉ tiêu sau:
Đếm tổng số các chồi có chiều cao ≥ 0,5cm tạo được trên mỗi mẫu cấy.
Hệ số nhân chồi được tính bằng số chồi/mẫu sử dụng phương pháp phân
tích thống kê bằng ANOVA với text LSD0,05.
2.2.2.2. Khảo sát quá trình tạo chồi từ lá
Thí nghiệm được thực hiện trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm ba chai thủy
tinh và số mẫu cấy là 10mẫu/chai. Mẫu cấy trong thí nghiệm này là những mẫu lá cây
Kiết Tường đã được cắt thành hình chữ nhật kích thước 3x5mm.
Bảng 2.2. Khảo sát khả năng tạo cụm chồi từ lá của cây Kiết Tường trong môi trường MS có bổ sung BA
Nghiệm thức BA(ppm) ĐC 0 B1 0,5 B2 1,0 B3 1,5 B4 2,0
Số liệu được ghi nhận sau 30 ngày nuôi cấy gồm các chỉ tiêu sau:
Số mẫu tạo chồi/tổng số mẫu cấy được xác định bằng cách đếm tổng số
mẫu hình thành chồi trên mỗi chai thủy tinh, từ đó tính tỉ lệ %, số mẫu
tạo chồi.
Số chồi/mẫu được xác định bằng cách đếm tất cả các chồi ≥ 0,5cm tạo được trên mỗi mẫu cấy, từ đó tính số chồi/mẫu sử dụng phương pháp
phân tích thống kê bằng ANOVA với text LSD0,05.
2.2.2.3. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh cây Kiết Tường
Thí nghiệm được thực hiện trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm ba chai thủy
tinh và số mẫu cấy là 7mẫu/chai. Mẫu cấy trong thí nghiệm là chồi cây Kiết Tường in vitro. Chiều cao chồi từ 1-1,5cm.
Bảng 2.3. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh trong môi trường MS có bổ sung NAA, IBA và GA3
Nghiệm thức GA3 IBA NAA
ĐC 0 0 0 TS1 0,01 TS2 0,03 TS3 0,5 0,05 TS4 0,01 TS5 0,03 TS6 0,1 1,0 0,05
2.2.3. Nghiên cứu tạo hạt nhân tạo từ chồi
2.2.3.1. Khảo sát ảnh hưỏng của thời gian đông tụ hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường Tường (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thí nghiệm này được tiến hành trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chai thủy tinh với số mẫu cấy là 12mẫu/chai. Thí nghiệm này được lặp lại ba lần.
Chuẩn bị:
Ba bình tam giác 250ml. Mỗi bình chứa 100ml dung dịch CaCl2 50mM
50ml dung dịch: môi trường tái sinh cây Kiết Tường (môi trường lỏng)
kết hợp dung dịch alginate 4% trong bình tam giác 100ml.
Các bình tam giác này sẽ được hấp khử trùng autoclave ở nhiệt độ 121oC, 1atm,
trong 15 phút, sau đó đem vào box cấy để thực hiện tạo hạt nhân tạo.
Mẫu dùng để tạo hạt nhân tạo là mẫu chồi từ lá cây Kiết Tường (sau 30 ngày nuôi cấy). Kích thước chồi từ 3-5mm. Các mẫu này cho vào bình tam giác chứa 50ml dung
dịch alginate 4%. Dùng pipet hút từ 3-5ml dung dịch alginate 4% (có chứa mẫu chồi)
nhỏ từ từ vào dung dịch CaCl2 50mM trên máy lắc từ khoảng 30 phút. Sau đó, các hạt
nhân tạo được tạo thành được vớt ra, rửa sạch bằng nước cất vô trùng và các hạt này
được cấy chuyển vào môi trường tái sinh cây.
Số liệu ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy gồm các chỉ tiêu:
Sinh khối tươi (g/cây): được xác định bằng cách cân lần lượt từng cây
một bằng cân phân tích có độ chính xác là 10-5g.
Chiều cao cây (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
Chiều dài rễ (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
2.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch CaCl2 lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường
Thí nghiệm này được tiến hành trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chai thủy tinh với số mẫu cấy là 12mẫu/chai. Thí nghiệm này được lặp lại ba lần.
Chuẩn bị:
100ml dung dịch CaCl2 25mM trong bình tam giác 250ml (E1).
100ml dung dịch CaCl2 50mM trong bình tam giác 250ml (E2).
100ml dung dịch CaCl2 75mM trong bình tam giác 250ml (E3).
50ml môi trường tái sinh cây Kiết Tường kết hợp dung dịch alginate 4%
trong bình tam giác 100ml.
Các bình tam giác này sẽ được hấp khử trùng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1atm,
trong 15 phút, sau đó đem vào box cấy để thực hiện tạo hạt nhân tạo.
Mẫu dùng để tạo hạt nhân tạo là mẫu chồi từ lá cây Kiết Tường (sau 30 ngày nuôi cấy). Kích thước chồi từ 3-5mm. Các mẫu này cho vào bình tam giác chứa 50ml dung dịch alginate 4%. Dùng pipet hút từ 3-5ml dung dịch alginate 4% (có chứa mẫu chồi)
nhỏ từ từ vào dung dịch (E1), (E2) và (E3) ở các thời gian đông tụ hạt tưong ứng. Hạt
nhân tạo được tạo thành sẽ được vớt ra và rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hạt này được cấy chuyển vào môi trường tái sinh cây.
Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy gồm các chỉ tiêu:
Sinh khối tươi (g/cây): được xác định bằng cách cân lần lượt từng cây
một bằng cân phân tích có độ chính xác là 10-5g.
Chiều cao cây (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
2.2.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường từ chồi cây Kiết Tường
Thí nghiệm này được tiến hành trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chai
thủy tinh với số mẫu cấy là 12mẫu/chai. Thí nghiệm này được lặp lại ba lần. Chuẩn bị:
100ml dung dịch CaCl2 có nồngđộ 50mM trong bình tam giác 250ml.
50ml dung dịch: môi trường tái sinh cây Kiết Tường (môi trường lỏng)
kết hợp dung dịch alginate 3% trong bình tam giác 100ml (D1).
50ml dung dịch: môi trường tái sinh cây Kiết Tường (môi trường lỏng)
kết hợp dung dịch alginate 4% trong bình tam giác 100ml (D2).
Các bình tam giác này sẽ được hấp khử trùng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1atm,
trong 15 phút, sau đó đem vào box cấy để thực hiện tạo hạt nhân tạo.
Mẫu dùng để tạo hạt nhân tạo là mẫu chồi từ lá cây Kiết Tường (sau 30 ngày nuôi cấy). Kích thước chồi từ 3-5mm. Các mẫu này được cho vào hai bình tam giác chứa
50ml dung dịch (D1) và (D2). Dùng pipet hút từ 3-5ml dung dịch D1 nhỏ từ từ vào dung dịch CaCl2 50mM trên máy lắc từ khoảng 40 phút. Các hạt nhân tạo được tạo
thành được vớt ra và rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó các hạt này được cấy
chuyển vào môi trường tái sinh cây.
Làm tương tự với dung dịch (D2). Riêng với mẫu đối chứng thì cấy chuyển chồi
trực tiếp lên môi trường tái sinh cây ( không có dung dịch alginate).
Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy gồm các chỉ tiêu:
Sinh khối tươi (g/cây): được xác định bằng cách cân lần lượt từng cây
một bằng cân phân tích có độ chính xác là 10-5g.
Chiều cao cây (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
Chiều dài rễ (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
2.2.3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate 4% kết hợp alginate chiếu xạ (300kGy) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi Kiết Tường (300kGy) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi Kiết Tường
Thí nghiệm này được tiến hành trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chai
Chuẩn bị:
100ml dung dịch CaCl2 có nồngđộ 50mM trong bình tam giác 250ml. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
20ml dung dịch: môi trường tái sinh cây Kiết Tường kết hợp dung dịch
alginate 4% và dung dịch alginate chiếu xạ 0,1% trong bình tam giác 100ml (KA1).
20ml dung dịch: môi trường tái sinh cây Kiết Tường kết hợp dung dịch
alginate 4% và dung dịch alginate chiếu xạ 0,2% trong bình tam giác 100ml (KA2).
20ml dung dịch: môi trường tái sinh cây Kiết Tường kết hợp dung dịch
alginate 4% và dung dịch alginate chiếu xạ 0,3% trong bình tam giác 100ml (KA3).
20ml dung dịch: môi trường tái sinh cây Kiết Tường kết hợp dung dịch
alginate 4% và dung dịch alginate chiếu xạ 0,4% trong bình tam giác 100ml (KA4).
Các bình tam giác này sẽ được hấp khử trùng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1atm,
trong 15 phút, sau đó đem vào box cấy để thực hiện tạo hạt nhân tạo.
Mẫu dùng để tạo hạt nhân tạo là mẫu chồi từ lá cây Kiết Tường (sau 30 ngày nuôi cấy). Kích thước chồi từ 3-5mm. Các mẫu này cho vào các bình tam giác chứa 10ml
dung dịch (KA1), (KA2), (KA3) và (KA4). Dùng pipet hút từ 3-5ml dung dịch (KA1)
(có chứa mẫu chồi) nhỏ từ từ vào dung dịch CaCl2 50mM trên máy lắc từ khoảng 40
phút. Các hạt nhân tạo được tạo thành sẽ được vớt ra và rửa sạch bằng nước cất vô trùng. Sau đó các hạt này được cấy chuyển vào môi trường tái sinh cây.
Làm tương tự với các dung dịch (KA2), (KA3) và (KA4). Số liệu ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy gồm các chỉ tiêu:
Sinh khối tươi (g/1cây): được xác định bằng cách cân lần lượt từng cây
một bằng cân phân tích có độ chính xác là 10-5g.
Chiều cao cây (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
2.2.3.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginat 4% kết hợp chitosan chiếu xạ (0,1%) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường. (0,1%) lên khả năng tạo hạt nhân tạo từ chồi cây Kiết Tường.
Thí nghiệm này được tiến hành trên 3 nghiệm thức. Mỗi nghiệm thức gồm 3 chai
thủy tinh với số mẫu cấy là 12mẫu/chai. Thí nghiệm này được lặp lại ba lần.
Chuẩn bị:
100ml: dung dịch CaCl2 có nồng độ 50mM kết hợp dung dịch chitosan (1000 kGy) 0,1% trong bình tam giác 250ml (KC1).
100ml: dung dịch CaCl2 50mM kết hợp dung dịch chitosan (100 kGy)
0,1% trong bình tam giác 250ml (KC2).
20ml: môi trường tái sinh cây kết hợp dung dịch alginate 4%.
Các bình tam giác này sẽ được hấp khử trùng autoclave ở nhiệt độ 1210C, 1atm,
trong 15 phút, sau đó đem vào box cấy để thực hiện tạo hạt nhân tạo.
Mẫu dùng để tạo hạt nhân tạo là mẫu chồi từ lá cây Kiết Tường (sau 30 ngày nuôi cấy). Kích thước chồi từ 3-5mm. Các mẫu này cho vào bình tam giác chứa 10ml: môi
trường tái sinh cây kết hợp dung dịch alginate 4%. Dùng pipet hút từ 3-5ml dung dịch (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
này (có chứa mẫu chồi) nhỏ từ từ vào dung dịch (KC1) trên máy lắc từ khoảng 40 phút.
Các hạt nhân tạo được tạo thành sẽ được vớt ra và rửa sạch bằng nước cất vô trùng.
Sau đó các hạt này được cấy chuyển vào môi trường tái sinh cây. Làm tương tự với dung dịch (KC2).
Số liệu được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy gồm các chỉ tiêu:
Sinh khối tươi (g/cây): được xác định bằng cách cân lần lượt từng cây
một bằng cân phân tích có độ chính xác là 10-5g.
Chiều cao cây (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
Chiều dài rễ (cm): được đo trực tiếp bằng thước có độ chính xác 1mm.
2.2.4. Phương pháp xử lí thống kê số liệu
Các thí nghiệm được bố trí theo mô hình khối ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần và các số
liệu sau khi thu nhập được xử lí thống kê theo phương pháp ANOVA và sử dụng text
Chương 3
KẾT QUẢ
VÀ
3.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được
3.1.1. Chế tạo và khảo sát đặc trưng của hạt chế tạo được từ alginate a. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate đến quá trình tạo hạt a. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ alginate đến quá trình tạo hạt
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ alginate đến quá trình tạo hạt
Cấu trúc hạt Kích thước hạt trung bình (mm)
Nồng độ
(%) Ban đầu Sau 4 giờ Sau 24 giờ Ban đầu Sau 4 giờ Sau 24 giờ
1 Hạt hình cầu, trong, móp méo nhiều chỗ. Hạt dễ bể. Không thay đổi nhiều so
với ban đầu.
Hạt teo và mất nước nhanh. Hạt teo đặc lại, rất nhỏ. 4,05±0,07 3,33±0,12 Không tiến hành đo kích thước. 2 Hạt hình cầu, trong, dễ bể. Hạt vẫn giữ nguyên hình dạng ban đầu, tuy nhiên hạt mất nước khá nhanh. Hạt teo và đông đặc gần hết. 4,03±0,06 3,8±0,04 2,0±0,11 3 Hạt hình cầu, trong, khó bể. Không thay đổi nhiều so với hình dạng ban đầu. Hạt mất nước nhanh và bị móp
méo nhiều
chỗ. 4,39±0,05 4,22±0,04 3,24±0,12 4 Hạt hình cầu, đục, Không thay đổi nhiều so Hạt mất nước khá 4,3±0,04 4,26±0,05 3,27±0,10
khó bể. với hình dạng ban đầu.
nhanh.
Hình 3.1. Hạt alginate (Alg) ở các nồng độ khác nhau
Quá trình tạo hạt nhân tạo từ alginate đã được nghiên cứu và ứng dụng. Qua khảo
sát cho thấy các đặc trưng của hạt alginate phụ thuộc rất lớn vào nồng độ của dung dịch alginate ban đầu. Nồng độ alginate càng cao thì độ bền của hạt càng lớn. Tuy nhiên nếu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nồng độ dung dịch alginate quá cao thì sẽ rất khó cho việc nhỏ giọt do độ nhớt quá lớn, hơn nữa hạt được tạo thành sẽ rất cứng.
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc trưng của hạt alginate có
nồng độ từ 1-4%. Kết quả nhận được được hiển thị ở Bảng 3.1.
Đối với hạt được tạo thành từ dung dịch alginate ban đầu là 1% thì kết quả cho
thấy:
Về hình dạng hạt: ban đầu hạt tạo thành có dạng hình cầu, trong, dễ bể nhưng sau 24 giờ bảo quản trong đĩa petri thì hạt teo đặc lại rất nhỏ.
Về kích thước hạt: ban đầu hạt tạo thành có kích thước 4,05mm nhưng
sau 24 giờ thì không thể tiến hành đo kích thước vì hạt bị teo lại quá nhỏ. Đối với hạt tạo thành từ dung dịch alginate ban đầu là 2% thì kết quả cho thấy:
Alg 4%
Alg 3%
Alg 1%
Về hình dạng hạt: ban đầu hạt tạo thành có dạng hình cầu trong, dễ bể nhưng sau 24 giờ bảo quản trong đĩa petri thì hạt bị teo và đông đặc lại.
Về kích thước hạt: ban đầu hạt tạo thành có kích thước 4,03mm nhưng
sau 24 giờ bảo quản trong đĩa petri thì kích thước hạt giảm khoảng 50,2% so với ban đầu.
Đối với hạt được tạo thành từ dung dịch alginate ban đầu là 3% thì kết quả cho thấy:
Về hình dạng hạt: ban đầu hạt tạo có dạng hình cầu, trong, khó bể nhưng
sau 24 giờ bảo quản trong đĩa petri thì hạt bị móp méo nhiều chỗ.
Về kích thước hạt: ban đầu hạt tạo thành có kích thước 4,39mm nhưng
sau 24 giờ bảo quản trong đĩa petri thì kích thước hạt giảm khoảng 26,2% so với ban đầu.
Đối với hạt được tạo thành từ dung dịch alginate ban đầu là 4% thì kết quả cho
thấy:
Về hình dạng hạt: ban đầu hạt tạo có dạng hình cầu, trong, khó bể và sau 24 giờ bảo quản trong đĩa petri thì hạt vẫn giữ nguyên hình dạng ban đầu.
Về kích thước hạt: ban đầu hạt tạo thành có kích thước 4,3mm nhưng sau
24 giờ bảo quản trong đĩa petri thì kích thước hạt giảm khoảng 23,76% so với ban đầu.
Như vậy hạt được tạo thành từ dung dịch alginate 3-4% cho kết quả khá tốt về độ
bền cũng như sự ổn định về kích thước hạt sau 24 giờ lưu giữ trong đĩa petri. Nghiệm
thức 4% tỏ ra ưu thế hơn và được lựa chọn cho các thí nghiệm khảo sát ở các bước tiếp