12. Van/ống Cryoststat trong
4.3. Thớ nghiệm lõm sàng trờn gia cầm
Như chỳng tụi đó trỡnh bày trong chương ba, chuẩn độ vi rỳt DHV1 được xỏc định theo phương phỏp Reed-Muench [64, 65]. Liều gõy bậnh thực nghiệm ELD50 thu được là 10-5,45/0,4 ml. Cỏc kết quả thớ nghiệm lõm sàng được trỡnh bày trong bảng 4.3.
Bảng 4.3. Cỏc kết quả thực nghiệm lõm sàng thu được từ cỏc lụ thớ nghiệm
Lụ TN Thời gian phỏt bệnh
Tỷ lệ tử
vong
Bệnh tớch thu được trờn gan Bạc màu Xuất huyết Xung huyết
Lụ 1 - - - - -
Lụ 2 - - - - -
Lụ 3 48 giờ 100% 80 % 30 % 20 %
Cỏc kết quả thu được cho chỳng ta thấy rằng, trong cỏc lụ thớ nghiệm đối chứng õm (lụ 1) và lụ thớ nghiệm thử nghiệm độc tố và sựảnh hưởng của chất lỏng từđối với vịt con (lụ 2), vịt con hoàn toàn khỏe mạnh, khụng biểu hiện bệnh tớch bờn ngoài cũng như trờn gan (xem hỡnh 4.17). Điều này cú thể khẳng định rằng quỏ trỡnh vệ sinh chuồng trại và cỏch nuụi thả vịt theo đỳng tiờu chuẩn thớ nghiệm, đảm bảo khụng cú cỏc bờnh truyền nhiễm khỏc. Hơn nữa, cỏc chất lỏng từ sử dụng trong thớ nghiệm khụng gõy độc tố cho vịt con trong thời gian thử nghiệm.
Hỡnh 4.17. Hỡnh ảnh gan vịt ở cỏc lụ đối chứng õm (Lụ 1- bờn trỏi) và lụ thử nghiệm
độc lực của chất lỏng từ (Lụ 2 - hỡnh bờn phải)
Hỡnh 4.18. Thể trạng của vịt con sau khi phỏt bệnh ở cỏc lụ thực nghiệm và lụ đối chứng dương
Đối với lụ đối chứng dương (lụ 3), dấu hiệu mệt mỏi nghiệm trọng ở cảđàn vịt xuất hiện sau 48 giờ. Sau 2 giờ tiếp theo, bệnh tớch chuyển biến sang trạng thỏi co giật, đầu ngoẹo về một phớa rồi chết. Hỡnh thỏi vịt lỳc chết là đầu ngoẹo về đằng sau, hai chõn duỗi thẳng (xem hỡnh 4.18). Tỷ lệ tử vong trong khoảng thời gian từ 48 đến 72 giờ là 100%. Bệnh tớch điển hỡnh trờn gan vịt thu được sau khi mổ khỏm bao gồm: 80% số con chết gan bị bạc màu; 30 % số con gan bị xuất huyết và 20% gan bị xung huyết (xem hỡnh 4.19). Bờn cạnh đú, kết quả thu được ở lụ thực nghiệm (lụ 4) cho thấy, sau 168 giờ mới thấy xuất hiện triệu chứng mỏi mệt ở vịt, tỷ lệ chết sau khi phỏt bệnh là 20% (2/10 con) (xem hỡnh 4.18). Bệnh tớch trờn gan thu được sau khi mổ khỏm cỏc con chết là 100% gan bị xung huyết, khụng cú hiện tượng bạc màu và xuất huyết ở
gan (xem hỡnh 4.20). Số vịt cũn lại khụng cú dấu hiệu bệnh tớch điển hỡnh trờn gan, thể trạng giống như kết quả thu được trong cỏc lụ thớ nghiệm 1 và 2. Điều đú cho thấy rằng, khi cú sự tham gia của chất lỏng từ trong liệu phỏp phõn tỏn thuốc curcumin theo phương phỏp thụ động, quỏ trỡnh phỏt bệnh chậm hơn (168 giờ) so với lụ đối chứng dương (48 giờ). Hiệu quảđiều trịđạt 80%.
Hỡnh 4.19. Cỏc hỡnh ảnh bệnh tớch trờn gan vịt sau khi mổ khỏm ở lụ đối chứng dương
Cỏc kết quả thớ nghiệm này cú thểđược giải thớch theo cỏc giải thiết sau:
Giả thiết thứ nhất, cỏc nhúm chức amino NH2 của chitosan cú thể liờn kết húa học với những chất như: chất bộo, cholesterol, lipit, axit mật trong hệ tiờu húa và đặc biệt là cỏc protein trờn bề mặt vi rỳt bao gồm: VP0, VP1, VP3 và VP4, sau đú bao bọc chỳng, ức chế quỏ trỡnh sinh khỏng nguyờn và thải chỳng ra khỏi cơ thể. Khả năng kết vún cỏc protein bề mặt của cỏc chất lỏng từ cũng được kiểm chứng bởi cỏc thớ nghiệm trong ống nghiệm. Cỏc kết quả thu được của thớ nghiệm này được biểu diễn trờn hỡnh 4.21. Chỳng ta quan sỏt thấy rằng, hiện tượng đúng vún protein xảy ra khi trộn hỗn hợp huyễn dịch vi rỳt DHV1 với chất lỏng từ (với tỷ lệ 1:1). Mặt khỏc hiện tượng đúng vún protein này chỉ xuất hiện khi bất hoạt vi rỳt ở nhiệt độ 100 oC [65]. Quỏ trỡnh proton húa bề mặt protein bởi cỏc polime chitosan được biểu diễn theo phương trỡnh phản ứng dưới đõy:
CS-NH2 + Protein-SH ặ CS-NH3S-Protein (ả) (4.5)
Hỡnh 4.21. Hỡnh ảnh minh họa phản ứng đúng vún protein trong ụng nghiệm
Mặt khỏc, như chỳng tụi đó đề cập trong chương hai, sự ảnh hưởng của curcumin lờn tế bào làm thay đổi cỏc yếu tố tăng trưởng và cỏc cytokine, ngăn chặn sự tỏc động của interleukin (IL)-6 thụng qua việc làm suy giảm sự tỏc động STAT3 và tỏc động õm tinhs đối với cỏc yếu tố tăng trưởng IL-2 trong cỏc tế bào lympho trờn cỏc khối u, khối viờm do vi rỳt gõy lờn [6]. Hơn nữa, curcumin khi thõm nhập vào cơ thể qua ruột, dạ dày …, nú lại bị thay đổi bởi cỏc enzim đặc hiệu (như enzim UDP- glucoronnosyl trong dạ dày) khiến nú bị thải đi trước khi tạo tỏc động đến tế bào bệnh hay khối viờm nhiễm dẫn đến khả năng phõn hủy tế bào bệnh, khối u bị suy giảm [6].
Giả thiết thứ hai, cỏc hạt nanụ từ tớnh ởđõy cú thể xem nhưđúng vai trũ giống như “mặt nạ” đỏnh lừa cỏc enzim giỳp cho curcumin dễ dàng cú thể thõm nhập qua
màng bào tương tế bào (bào quang), tỏc động lờn cỏc đại thực bào, cỏc khối viờm do vi rỳt tỏc động. Mặt khỏc, khi vi rỳt thõm nhập vào cơ thể, cỏc protein bề mặt sẽ tỏc động làm suy yếu chất chống oxy húa nội sinh glutathion (glutathion là một chất chứa sulfur kớch thước nhỏ cú chức năng chống oxy húa cơ bản nhất của cơ thể) dẫn đến sự tăng trưởng cơ quan thụ cảm của yếu tố tăng trưởng biểu mụ [6]. Trong trường hợp này, curcumin sẽ phối hợp với cỏc glutathion tạo thành glutathion peroxidaza. Cỏc chất này sẽ đúng vai trũ phỏ hủy và chuyển húa hidrogen peroxit thành nước. Mụ hỡnh tương tỏc giữa curcumin và glutathion được minh họa trờn hỡnh 4.22.
Hỡnh 4.22. Mụ hỡnh tương tỏc giữa curcumin và glutathion
Giả thiết thứ ba, khi curcumin đó thõm nhập vào tế bào, nú sẽ tỏc động lờn vựng bị viờm do vi rỳt gõy lờn và làm suy giảm sự kết đỏm của cỏc phõn tử bề mặt tế bào dẫn đến sự suy giảm quỏ trỡnh tăng trưởng của khối viờm nhiễm. Mặt khỏc, nú làm suy giảm sự sản sinh ra cytokin: TBF, IL-1, IL-6, IL-8 và chemokin kớch thớch sự tăng trưởng vựng nhiễm (xem hỡnh 4.23).
Túm lại, trong cỏc thớ nghiệm lõm sàng trờn vịt con, chỳng tụi đó thu được cỏc kết quả chớnh sau đõy:
- Tiếp cận và xõy dựng quy trỡnh thớ nghiệm lõm sàng trờn đối tượng sinh học cụ thể - vi rỳt viờm gan vịt typ 1.
- Khảo sỏt và đỏnh giỏ được triệu chứng và bệnh tớch trờn vịt con khi bị nhiễm vi rỳt viờm gan vịt typ1 (DHV1).
- Đó khảo sỏt được vai trũ, ảnh hưởng của chất lỏng từ lờn vịt con và trong quỏ trỡnh điều trị bệnh viờm gan vịt.
Nhưng vấn đềđặt ra ởđõy là: cơ chế bảo vệ của cỏc chế phẩm từđược sử dụng trong thớ nghiệm này ra sao? Độc lực của chế phẩm này ở mức độ nào? Chế phẩm từ - sinh học này liệu cú thể vụ hiệu húa hoạt động của vi rỳt hay bổ trợ chức năng phũng vệ cho cỏc tế bào chống lại cỏc tỏc động của vi rỳt? Mức độđỳng đắn của cỏc giả thiết mà chỳng tụi đề cập ở trờn đõy đến đõu?... Tất cả cỏc vấn đề này cũn là một thỏch thức quỏ lớn đối với chỳng tụi. Dự sao với những phỏt hiện này, cho phộp chỳng tụi cú quyền hy vọng về một chế phẩm từ - sinh học được tạo bởi từ sự kết hợp giữa cỏc hạt nanụ từ tớnh với cỏc polime và thuốc điều trị cú nguồn gốc tự nhiờn cú thể ứng dụng trong sinh học như: phũng và trị bệnh gia cầm, nụng sản…