P hn mềm gắn kết AutoDock và động lực phân tử GROMACS
3.2.2. Các mô hình enzym
Một cấu trúc tinh thể của PBP2a (PDB mã là 1MWU) đã được sử dụng như một điểm khởi đầu của nghiên cứụ70
Chỉ chuỗi A của enzym được giữ lạị Hình 3.6 chỉ ra cấu trúc tâm hoạt động của phức axyl giữa phối tử MC1 và PBP2a, tương ứng với sản phẩm của phản ứng. Trong tệp PDB, Ser403 và phối tử MC1 được xác định như là một axit amin đơn với số thứ tự là 403. Axit amin này được chia thành hai axit amin riêng biệt.
100
Hình 3.6. Cấu trúc X-ray của PBP2a trong phức với MC1 (mã trong PDB là 1MWU)
Thật không may, tọa độ của một vài axit amin bị thiếu trong tệp 1MWỤ Các tọa độ của Lys506, Lys604, Gly611, và Arg612 do đó được lấy từ một cấu trúc X-ray (PDB mã 1VQQ) cho protein tương tự trong dạng apọ Phần mềm MOLDELLER được sử dụng để thêm các axit amin còn thiếu khác (Met605, Lys606, Gln607, Gly608, Glu609, và Thr610).31 Sau đó, các nguyên tử hydro đã được thêm vào bằng phần mềm VMD.56
Chúng tôi thực hiện phân tích PROPKA68,16 và kiểm tra trực quan 1MWỤpdb để xác định các trạng thái proton hóa của His129 và His293 như HIE và các axit amin His khác như HID. đây, HID và HIE theo hệ thống danh pháp AMBER và chuẩn đối với các histidine trung tính với trạng thái proton hóa các nguyên tử N1 và N2, tương ứng. Các điện tích nguyên tử của các phối tử đã được xác định theo phương pháp RESP bằng cách sử dụng Gaussian 0937
và ANTECHAMBER. Để làm điều này, chúng tôi đã tối ưu hóa hình học của các phối tử ở mức B3LYP/6-31G*.17,67,97,46
Trước tiên chúng tôi thực hiện tối ưu hóa hình học của toàn bộ enzym bằng phương pháp cơ học phân tử với trường lực AMBER19
đã được thực hiện bằng phần mềm Gaussian 09 để nhận được một cấu hình ban đầu tốt cho những tính toán ONIOM tiếp theọ Vì hoàn thành các tham số MM là không có sẵn cho phối tử MC1, các nguyên tử trong vùng QM (xem dưới đây) đã
101
được cố định qua các tính toán MM. Cần lưu ý rằng trong các tính toán ONIOM sau (đoạn tiếp theo), phối tử đã được xử lý bằng một phương pháp QM và đã được tối ưu hóạ Cấu hình phối tử trong các tệp PDB tương ứng là sản phẩm đã bị axyl hóạ Vì vậy, chúng tôi thay đổi chút ít cấu hình của các phối tử để chuẩn bị cấu hình cho phức michaelis trước khi axyl hóa, cụ thể là, trạng thái trước khi phản ứng.
Một cách cụ thể hơn, vòng bốn cạnh bị phá vỡ trong cấu trúc X-ray đã được đóng lại để tạo thành mô hình MC1. Các tính toán MM đã được thực hiện từng bước một như saụ Đầu tiên, chúng tôi tối ưu hóa các nguyên tử hydro trong hệ thống, trong khi cố định phần còn lại của các nguyên tử. Một điện tích nguyên tử -0,055 đã gán cho nguyên tử H liên kết của Ser403, do vậy các điện tích AMBER tổng của các nguyên tử QM bằng không. Hệ có chứa 642 axit amin (10483 nguyên tử). Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu tất cả các axit amin trong 1MWỤpdb và lưu ý đánh dấu các nguyên tử trong bán kính 20 Å từ Oxy của nhóm OH Ser403. Những axit amin này được phép di chuyển trong các tính toán tối ưu hình học tiếp theo, trong khi tất cả các nguyên tử bên ngoài của khu vực này được giữ cố định. Trong bước đầu tiên, các nguyên tử xương sống trong vùng tối ưu hóa đã được cưỡng bức và chỉ có các axit amin chuỗi nhánh được tối ưụ Các cưỡng bức đối với các nguyên tử xương sống sau đó được giải phóng, do đó, tất cả các nguyên tử trong bán kính 20 Å đã được tối ưu hóạ Tuy nhiên, các nguyên tử QM bị đông cứng ở giai đoạn nàỵ
Sau đó tối ưu hóa hình học được thực hiện cho khu vực đã xác định bởi bán kính 20 Å (xem ở trên) với ONIOM (B3LYP/6-31G: AMBER) và tiếp đến là tối ưu bằng phương pháp ONIOM (B3LYP/6-31G*: AMBER)74,92,103,98
. Sơ đồ nhúng cơ học của ONIOM (ONIOM -ME) đã được sử dụng để tối ưu hóa hình học, và sơ đồ nhúng điện tích (ONIOM-EE) cũng được sử dụng cho
102
tính toán điểm đơn. Phối tử và các chuỗi nhánh của Ser403 được xử lý bằng cơ học lượng tử. Đối với phản ứng của MC1, bước đầu tiên của phản ứng đã được giả định là được tấn công của nhóm OH của SERINE lên nhóm cacbonyl của vòng -lactam của phối tử. Vì vậy chúng tôi sử dụng khoảng cách C-O như là tọa độ phản ứng. Tính toán quét hồi phục được thực hiện bằng cách thay đổi dần dần khoảng cách C-O trong khi tối ưu hóa hoàn toàn tất cả các tọa độ khác (phần QM và phần MM trong vòng bán kính 20 Å). Bước thứ hai của phản ứng được giả định là sự phân tách liên kết N-C của - lactam. Vì vậy tính toán hồi phục quét ở đây được thực hiện bằng cách sử dụng khoảng cách N-C như là tọa độ phản ứng.
Để làm một so sánh giữa các phản ứng của MC1 và NC1, cấu hình tối ưu ONIOM của phức MC1 được sử dụng như là điểm khởi đầu cho những tính toán của phức NC1. Các tọa độ của MC1 được thay thế bởi NC1 lấy từ cấu trúc X-ray (PDB mã 1MWS). Vì tệp PDB cho phức NC1 là một phức axyl hóa (sau khi phản ứng), chúng tôi cũng đã chuẩn bị tọa độ cho một phức trước axyl hóa bằng cách điều chỉnh hình học, như chúng tôi đã làm cho phức MC1. Trong quá trình quét hồi phục, khoảng cách liên kết C-O cũng được sử dụng như là tọa độ phản ứng cho bước đầu tiên trong phản ứng của NC1 với PBP2ạ Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy rằng liên kết N-C dễ dàng bị phá vỡ trong bước đầu tiên trong phản ứng của NC1, và bước thứ hai là proton chuyển từ các nguyên tử oxy của nhóm cacboxyl tới nguyên tử nitơ. Vì vậy, chúng tôi sử dụng khoảng cách N-H như tọa độ phản ứng cho bước thứ hai trong phản ứng của NC1.
103