Chúng tôi đã giải trình tự 26/421 mẫu và cho kết quả là 1 đột biến ở exon 1 và 5 dạng đột biến IVS (intervening sequence) ở intron và 5’ UTR (untranslate region). Kết quả giải trình tự 26 mẫu được trình bày trong bảng 3.4.
52
Bảng 3.4. Kết quả giải trình tự 26 mẫu
Kí hiệu mẫu
exon 1 Intron 1 exon
2 exon 3 exon 4 intron 4 exon 5 exon 6 Intron 6 exon 7
FB01 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB02 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB03 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB04 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB05 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB06 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB07 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB08 BT IVS1+17 A>G BT BT BT BT BT BT BT BT
FB09 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB10 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB26 5'UTR -12 G>A BT BT BT BT BT BT BT IVS6-22 C>T BT
FB44 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB64 c.[178 C>T]; [0],p.P60S BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
53
FB70 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB74 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB79 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB80 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB84 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB85 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB133 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB331 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB334 BT BT BT BT BT BT BT BT BT BT
FB345 BT BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
FB378 5'UTR -10 C>T BT BT BT BT IVS4-16 A>G BT BT IVS6-22 C>T BT
54
Hình 3.7. Đoạn trình tự exon 1 đột biến c.[178 C>T] ; [0], p.P60S
Trong số 26 mẫu được giải trình tự, chỉ có duy nhất một mẫu FB 64 có đột biến ở vùng mã hoá axit amin thuộc exon 1. Đó là đột biến điểm ở vị trí nucleotide 178 thay thế C bằng T dẫn tới sự thay đổi axit amin thứ 60 từ Proline thành Serine. Đây là đột biến mới chưa từng công bố trong y văn. Mẫu đột biến FB 64 là mẫu có hoạt độ enzyme α – Gal A bằng 0.17, thấp nhất trong số 26 mẫu được giải trình tự. Bệnh nhân FB 64 là bệnh nhân nam 56 tuổi. Kết quả siêu âm cho thấy các chỉ số LVMI bằng 205 g/m2, LVPWd bằng 22.6 mm đều rất cao. Bệnh nhân này chỉ biểu
c.[178 C>T] ; [0], p.P60S
55
hiện các đặc điểm của bệnh Fabry thể không điển hình như phì đại cơ tim với các triệu chứng khó thở, đau thắt ngực, tim đập nhanh đặc biệt là khi lao động hoặc vận động mạnh, ngoài ra không mang các đặc điểm khác của bệnh Fabry thể điển hình. Như vậy, tỉ lệ đột biến gen GLA gây bệnh Fabry ở nhóm bệnh nhân phì đại cơ tim trong nghiên cứu này là 1/421.
Trong nghiên cứu của Nakao và cộng sự năm 1995 trên 230 bệnh nhân nam phì đại cơ tim đã phát hiện 2 đột biến gen GLA ở vùng mã hoá axit amin thuộc exon 1 và exon 6, có 5 bệnh nhân không có đột biến ở vùng mã hoá axit amin nhưng có α – galactosidase mARN giảm rõ rệt so với bình thường. Cả 7 bệnh nhân này đều biểu hiện các đặc điểm của bệnh Fabry không điển hình [55]. Năm 2002, B Sachdev và cộng sự nghiên cứu trên 153 bệnh nhân nam phì đại cơ tim khởi phát muộn đã phát hiện ra 6 bệnh nhân bị đột biến gen GLA với 4 dạng đột biến khác nhau gồm 3 đột biến thay thế và 1 đột biến mất nucleotide [11]. Năm 2011, Albert A Hagege và cộng sự cũng sàng lọc trên 392 bệnh nhân phì đại cơ tim và phát hiện ra 4 đột biến gen GLA [6]. Năm 2010, Ole Havndrup đã nghiên cứu 90 đối tượng và người thân của họ, nhóm tác giả loại trừ 31 trường hợp có đột biến gen sarcomer, trong 59 trường hợp còn lại họ đã phát hiện được 3 đột biến gen GLA [57].
Như vậy tỉ lệ đột biến gen GLA khi sàng lọc các bệnh nhân phì đại cơ tim trong các nghiên cứu là rất khác nhau. Điều này có thể do sự khác nhau giữa các dân tộc, quốc gia, hoặc cũng có thể do số lượng mẫu đem sàng lọc chưa đủ lớn để đưa ra một tỷ lệ chung.
Ngoài một đột biến duy nhất ở vùng mã hoá axit amin của exon 1, bảng 3.4 cho thấy có 5 dạng đột biến IVS và 5’UTR xuất hiện với tần số khá cao. Có tới 13/26 mẫu mang ít nhất 1 trong 5 dạng đột biến này. Trong đó 10/26 mẫu (38%) mang đột biến 5'UTR -10 C>T, 12/26 mẫu (46%) mang đột biến IVS4-16 A>G, 13/26 mẫu (50%) mang đột biến IVS6-22 C>T, 10/26 mẫu (38%) mang cả 3 loại đột biến trên. Ngoài ra còn có hai dạng đột biến là IVS1+17 A>G và 5'UTR -12 G>A.
56
Hình 3.8. Đoạn trình tự exon 1 có đột biến 5'UTR -12 G>A
57
Hình 3.10. Đoạn trình tự nucleotide có đột biến IVS1+17 A>G
Ở Đài Loan đã có một nghiên cứu sàng lọc lớn trên 110 027 trẻ sơ sinh, kết quả cho thấy có một dạng đột biến “hotspot” phổ biến trong cộng đồng là đột biến IVS4+919 G>A với tỷ lệ 1/1600 trẻ [32]. Một số nghiên cứu cũng cho thấy rằng đột biến IVS4+919 G>A có thể ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme α – Gal A và có liên quan đến một số biểu hiện bệnh tim khởi phát muộn [34, 44, 69]. Năm 2006, Junaid Shabbeer và cộng sự đã phát hiện ra 50 đột biến trên gen GLA, trong đó có 5 đột biến IVS, 1 trong 5 đột biến đó (IVS5 + 3A >G) tạo nên 2 sản phẩm phiên mã bất thường [39]. Ellen Schäfer và cộng sự tìm ra 34 đột biến mới trên 121 bệnh nhân Fabry, có tới 5.6 % mang các đột biến IVS [25]. Khi Christine M. Eng và cộng sự nghiên cứu trên các bệnh nhân Fabry thể điển hình, họ đã phát hiện được 35 dạng đột biến gen GLA trong đó có 1 đột biến IVS [19]. Một số nghiên cứu khác trong các gia đình có người mắc bệnh Fabry cũng phát hiện ra nhiều đột biến IVS và 5’UTR. Robert Dobrovolny và cộng sự đã phát hiện 21 đột biến gen GLA ở 22 gia đình Fabry, trong đó có 3 đột biến IVS [63]. Diana Blaydon và cộng sự đã nghiên cứu trên 35 gia đình Fabry và tìm thấy 20 đột biến mới ở gen GLA trong đó có 1 đột biến IVS [24]. Theo thống kê, trong số 599 đột biến gen GLA ở bệnh nhân Fabry, có 7.4% là các đột biến ở vị trí cắt nối (splice site) [23]. Các kết quả trên cho thấy các dạng đột biến IVS là khá phổ biến. Các đột biến 5’ UTR ít được tìm thấy hơn và cũng chưa có các nghiên cứu chi tiết.
58
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy 3 loại đột biến 5'UTR -10 C>T; IVS4-16 A>G; IVS6-22 C>T xuất hiện với tần số rất cao, đây có thể là các đột biến “hotspot” hoặc đa hình trong cộng đồng người Việt Nam. Chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của các đột biến này đến sự biểu hiện của gen GLA, hoạt độ enzyme α – Gal A cũng như sự liên quan của các đột biến này đối với bệnh phì đại cơ tim. Cần có những công trình nghiên cứu sàng lọc trên số lượng lớn cá thể để có thể đưa ra được kết luận chính xác.
59
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme α – Gal A của 421 mẫu máu lấy từ các bệnh nhân phì đại cơ tim cho thấy hoạt độ enzym có giá trị từ 0.17 – 9.18 µmol/h/L, giá trị mean ± SD bằng 1.84 ± 0.93 µmol/h/L. Kết quả này được đánh giá là thấp hơn so với một số nghiên cứu trên thế giới.
2.Kết quả phân tích gen GLA của 26 mẫu có hoạt độ enzyme α – Gal A suy giảm mạnh đã phát hiện ra 6 đột biến, trong đó có 1 đột biến thay thế nucleotide c.[178 C>T] ; [0], p.P60S ở vùng mã hoá axit amin thuộc exon 1. Đây là đột biến mới chưa từng được công bố trong y văn. Các đột biến còn lại là các đột biến ở vùng 5’UTR và intron bao gồm: 5'UTR -10 C>T; IVS4-16 A>G; IVS6-22 C>T; IVS1+17 A>G và 5'UTR -12 G>A. Trong đó các đột biến 5'UTR -10 C>T; IVS4-16 A>G; IVS6-22 C>T xuất hiện với tần số khá cao, và có tới 10/26 mẫu mang cả 3 loại đột biến trên.
KIẾN NGHỊ
Từ kết quả trên, tôi xin đưa ra một số kiến nghị như sau:
1. Mở rộng nghiên cứu sàng lọc bệnh Fabry bằng phương pháp xác định hoạt độ enzyme α – Gal A trên đối tượng phì đại cơ tim và người bình thường từ đó xác định dải tham chiếu về hoạt độ enzyme enzyme α – Gal A ở người Việt Nam.
2. Đi sâu nghiên cứu về biểu hiện gen GLA trên đối tượng phì đại cơ tim, góp phần giải thích nguyên nhân hoạt độ enzyme α – Gal A trên đối tượng này thấp hơn so với một số nghiên cứu trên thế giới.
60
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hoá sinh học thực nghiệm, NXB Giáo dục Việt Nam. 2. Đặng Vạn Phước, Nguyễn Văn Trí (2010), Nguyên lý siêu âm tim, ĐH Y Dược
TPHCM.
3. Khuất Hữu Thanh (1997), Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen, NXB KHKT HN.
4. Nguyễn Anh Vũ (2008), Siêu âm tim từ căn bản đến nâng cao, NXB ĐH Huế.
Tiếng anh
5. Adriana Rodríguez-Marí, M. José Coll, Amparo Chabás (2003), “Molecular Analysis in Fabry Disease in Spain: Fifteen Novel GLA Mutations and Identification of a Homozygous Female”, Human mutation, 22(3), pp. 258. 6. Albert A Hagege, Eric Caidron,Damy T, Roudaut R, Etchecopar – Chevreuil
C, Tran TC, Jabbour F, Boucly C, Prognon P, Charron P, Dominique P Germain (2011), “Screening patients with hypertrophic cardiomyopathy for Fabry disease using a filter-paper test: the FOCUS study”, Heart, 97(2), pp. 131 -136.
7. Ali J. Marian (2010), “Update on Hypertrophic Cardiomyopathy”, Texas Heart Institute Journal, Tex heart inst, 37(3), pp. 322 -323.
8. Andre Keren, Petros Syrris and William J McKenna (2008), “Hypertrophic cardiomyopathy: the genetic determinants of clinical disease expression”, Nat Clin Pract Cardiovasc Med, 5(3), pp. 158 – 68.
9. Andreas Perrot, Karl Josef Osterziel, Michael Beck, Rainer Dietz, Christoph Kampmann (2002), “Fabry Disease: Focus on Cardiac Manifestations and Molecular Mechanisms”, Herz, 27(7), pp. 699 – 702.
10. Angéla Dajnoki, György Fekete, Joan Keutzer, Orsini JJ, De Jesus VR, Chien YH, Hwu WL, Lukacs Z, Muhl A, Zhang XK, Olaf Bodamer (2010), “Newborn screening for Fabry disease by measuring GLA activity using
61
tandem mass spectrometry”, Clinica Chimica Acta, 411(19-20), pp.1428- 1431.
11. B. Sachdev, T. Takenaka, H. Teraguchi, C. Tei, P. Lee, W.J. McKenna and P.M (2002), “Prevalence of Anderson-Fabry Disease in Male Patients With Late Onset hypertrophic cardiomyopathy”, Circulation, 105, pp. 1407 – 1411.
12. Barry J. Maron (2002), “Hypertrophic Cardimyopathy a systematic review”,
The Journal of the American Medical Asociation, 287(10), pp.1308-1320. 13. Barry J. Maron, Julius M.Gardin, John M. Flack, Samuel S. Gidding, Tom T.
Kurosaki, Diane E. Bild (1995),“Prevalence of hypertrophic cardiomyopathy in a general population of young adults: echocardiographic analysis of 4111 subjects in the Cardia Study”, Circulation, 92(4), pp. 785-789.
14. Barry J. Maron, Martin S. Maron, Christopher Semsarian (2012), “Genetics of Hypertrophic Cardiomyopathy After 20 Years”, Journal of the American College of Cardiolog, 60(8), pp. 705-715.
15. Bernstein H. S, Bishop D. F, Astrin K. H, Kornreich R, Eng C. M, Sakuraba H, Desnick R. J (1989), “Fabry disease: six gene rearrangements and an exonic point mutation in the alpha-galactosidase gene”, J. Clin. Invest, 83, pp. 1390- 1399.
16. Blanch L. C, Meaney C, Morris C. P (1996), “A sensitive mutation screening strategy for Fabry disease: detection of nine mutations in the alpha- galactosidase A gene”, Hum. Mutat, 8, pp. 38-43.
17. C. Filoni , A. Caciotti, L. Carraresi (2010), “Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease”, Biochimica Biophysica Acta, 1802(2), pp. 247 – 252.
18. C. Ronald Scott, Susan Elliott, Norman Buroker, Lauren I. Thomas, Joan Keutzer, Michael Glass, Michael H. Gelb, Frantisek Turecek (2013), “Identification of Infants at Risk for Developing Fabry, Pompe, or
62
Mucopolysaccharidosis-I from Newborn Blood Spots by Tandem Mass Spectrometry”, The Journal of Pediatrics, 163(2), pp.498-503.
19. Christine M. E, Grace A. A, Tania S. B, Annette L. E, Marcus D. S, Robert J. D (1997), “Fabry Disease: Thirty-Five Mutations in the a-Galactosidase A Gene in Patients with Classic and Variant Phenotype”, Molecular Medicine, 3(3), pp. 174-182.
20. Christoph Kampmann, Christiane M. Wiethoff, Catharina Whybra, Frank A. Baehner, Eugen Mengel, Michael Beck (2007), “Cardiac manifestations of Anderson-Fabry disease in children and adolescents “, Acta Pædiatrica, 97(4), pp. 463 – 469.
21. Christoph Kampmann, Frank Baehner, Markus Ries, Michael Beck (2002), “Cardiac Involvement in Anderson-Fabry Disease”, J Am Soc Nephrol, 13, pp. 147 – 149.
22. De Jesus V.R, Zhang X.K, Keutzer J, Bodamer O.A, Mühl A, Orsini J.J, Caggana M, Vogt RF, Hannon WH (2009), “Development and evaluation of quality control dried blood spot materials in newborn screening for lysosomal storage disorders”, Clinical Chemistry, 55(1), pp. 158 – 164.
23. Deborah Elstein, Gheona Altarescu, Miachael Beck (2010), Fabry disease, Spinger.
24. Diana Blaydon, Jane Hill, and Bryan Winchester (2001),“Fabry Disease: 20 novel GLA mutations in 35 families”, Human mutation, 18(5); pp. 459.
25. Ellen Schäfer, Karin Baron, Urs Widmer, Deegan P, Neumann HP, Sunder – Plassmann G, Johansson JO, Whybra C, Ries M, Pastores GM, Mehta A, Beck M, Andreas Gal (2005), “Thirty-four novel mutations of the GLA Gene in 121 patients with Fabry disease”, Human mutation, 25(4), pp.412.
26. Eng C. M, Desnick R. J (1994), “Molecular basis of Fabry disease: mutations and polymorphisms in the human alpha-galactosidase A gene”, Hum. Mutat, 3, pp. 103-111.
63
27. Genzyme Canada Inc (2007), Lysosomal storage disorders, Genzyme corporation.
28. Germain D, Biasotto M, Tosi M, Meo T, Kahn A, Poenaru L (1996), “ Fluorescence-assisted mismatch analysis (FAMA) for exhaustive screening of the alpha-galactosidase A gene and detection of carriers in Fabry disease”, Hum. Genet, 98, pp. 719-726.
29. Hitoshi Sakuraba, Akihiro Oshima, Yukiko Fukuhara, Michie Shimmoto, Yoshiro Nagao, David F, Bishop Robert J. Desnick, Yoshiyuki Suzuki (1990), “Identification of Point Mutations in the a-Galactosidase A Gene in Classical and Atypical Hemizygotes with Fabry Disease”, Am. J. Hum. Genet, 47, pp.784-789.
30. Hsiang Y. L, Cheng H. H, Yu H. C, Chong K. W, Hsu J. H, Lee P. C, Cheng K.H, Chiang C. C, Ho H. J, Lin S. P, Chen S. J, Lin P. K, Dau M. N (2010), “Enzyme assay and clinical assessment in subjects with a Chinese hotspot late-onset Fabry mutation (IVS4+919G→A)”, Journal of Inherited Metabolic Disease, 33, pp. 619–624.
31. Hsiang-Yu Lin, Hao-Chuan Liu, Yu-Hsiu Huang, Yu Hsiu Huang, Hsuan Chieh Liao, Ting Rong Hsu, Chia I Shen, Shao Tzu Li, Cheng Fang Li, Li Hong Lee, Pi Chang Lee, Chun Kai Huang, Chuan Chi Chiang, Ching Yuang Lin, Shuan Pei Lin, Dau-Ming Niu (2013), “Effects of enzyme replacement therapy for cardiac-type Fabry patients with a Chinese hotspot late-onset Fabry mutation (IVS4+919G>A)”, BMJ open, 3(7).
32. Hsiang-Yu Lin, Kah-Wai Chong, Ju-Hui Hsu, Hsiao-Chi Yu, Shih CC, Huang CH, Lin SJ, Chen CH, Chiang CC, Ho HJ, Lee PC, Kao CH, Cheng KH, Hsueh C, Dau Ming Niu (2009), “High Incidence of the Cardiac Variant of Fabry Disease Revealed by Newborn Screening in the Taiwan Chinese Population”, Circulation Cardiovascular Genetics, 89.
33. Hsiang-Yu Lin, Yu-Hsiu Huang, Hsuan-Chieh Liao, Liu H. C, Hsu T. R, Chen C. L, Li S. T, Lee L. H, Lee P. C, Huang C. K, Chiang C. C, Lin S. P, Dau
64
M. N (2013), “Clinical observations on enzyme replacement therapy in patients with Fabry disease and the switch from agalsidase beta to agalsidase alfa”, Journal of the Chinese Medical Association, 77, pp. 190-197.