- Mẫu máu sẽ được lấy từ những bệnh nhân đã được lựa chọn, máu được thu thập vào trong ống có chứa ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA).
- Các mẫu được lựa chọn phân tích trình tự gen GLA là các mẫu có hoạt độ enzyme thấp nhất (<20% hoạt độ enzyme bình thường)
- ADN sẽ được phân lập từ máu toàn phần.
- Các phân đoạn của gen GLA sẽ được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng các cặp mồi thích hợp.
a) Tinh sạch ADN
Vật liệu và hóa chất:
35
- Đệm ly giải: 320mM sucrose; 10mM Tris – HCl pH 7,5; 5mM MgCl2; 1% (v/v) Triton X -100.
- Dung dịch pro K: 60µg/ml proteinase K. Dung dịch EDTA 10mM
- Đệm PBND (PCR Buffer with Nonionic Detergents): 10mM Tris- HCl pH 8,3; 2,5mM MgCl2; 50mM KCl; 0,1mg/ml gelatin; 0,45% (v/v) Nonidet P40; 0,45% (v/v) Tween 20; khử trùng và hòa gelatin; bảo quản đông lạnh. Bổ sung Pro K trước khi dùng.
Tiến hành
1. Thu 65 - 100µl máu qua ống dẫn vi mao đã tráng heparin vào ống eppendorf 1,5ml chứa 20 µl dung dịch EDTA. Hòa ngay để chống đông. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh trước khi dùng.
2. Bổ sung 200 µl đệm ly giải vào mỗi ống và lắc rung. Ly tâm 25 giây với 25.000 vòng/phút để tủa genome. Gạn bỏ dịch nổi và làm lại bước này 2 – 4 lần cho đến khi không còn hemoglobin.
3. Hòa tủa genome vào 100 µl PBND với 60 µg/ml pro K và ủ 60 phút ở 550C. Hâm nóng mẫu lên 970C trong 10 phút để bất hoạt Pro K.
b) Phản ứng PCR
Vật liệu và hóa chất:
- Dung dịch mồi (do trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, bệnh viện đa khoa cựu chiến binh Đài Bắc cung cấp - Bảng 2.3)
- Đệm 10X PCR.
- Taq pol: Taq polymerase - Dung dịch MgCl2 15mM
- Hỗn hợp dNTP: 2,5mM mỗi loại
36
Bổ sung 1 - 5 µl dung dịch ADN vào hỗn hợp PCR chứa: 2,5 µl đệm 10x PCR; 1,5µl MgCl2; 2 µl hỗn hợp dNTP; 0,5 µl mồi xuôi; 0,5 µl mồi ngược; 0,1 µl Taq polymerse, bổ sung H2O cho tổng dung dịch PCR bằng 25 µl.
Chạy PCR theo chu trình nhiệt trong bảng 2.4.
Bảng 2.3. Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi, kích thước sản phẩm PCR
Tên cặp mồi
Trình tự nucleotide của mồi Kích thước
sản phẩm
Nhiệt độ bắt cặp
GLA 1F 5’ GTT GCC AGA GAA ACA ATA ACG 3’
391 bp 630C
GLA 1R 5’ GTT GAG ACT CTC CAG TTC CCC 3’
GLA 2F 5’ ATG GGA GGT ACC TAA GTG TTC 3’
312 bp 620C
GLA 2R 5’ GAG GGC TGT TTC TAA AC AAG C 3’
GLA 3F 5’ GGT GAC TCT TTT CCT CCC TCT 3’
281 bp 630C
GLA 3R 5’ TTG GTT CTT TGG CTC AGC TAC 3
GLA 4F 5’ TAT AGC CCC AGC TGG AAA TTC 3'
241 bp 620C
GLA 4R 5’ GTT GGA CTT TGA AGG AGA CCT T 3’
GLA 5,6F 5’ GAA GGC TAC AAG TGC CTC CT 3’
970 bp 600C
GLA 5,6R 5’ GAG AGA GGT CGT TCC CAC AC 3’
GLA 7F 5’ TCA AGC CAA AGC TCT CCT TC 3’
695 bp 610C
GLA 7R 5’ TGG AGA AAA AGG TGG ACA G 3’
IVS4F 5’ TCT GTC CCT CAA CAC TGC AA 3’
445 bp 600C
IVS4R 5’ TAG GCA GGT GGG ATA TCA GG 3’
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR
Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
940C 2 phút 1 940C 30 giây 35 60-630C 30 giây 720C 1 phút 720C 1 phút 1 40C Bảo quản
37