Kỹ thuật giải trình tự gen chính là phương pháp xác định sự sắp xếp của các loại nucleotide trên phân tử ADN. Có hai phương pháp xác định trình tự chính là phương pháp hoá học của Maxam – Gillbert (1977) và phương pháp enzyme học của Sanger.
27
Nguyên tắc của phương pháp Maxam – Gillbert dựa trên phản ứng hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử ADN cần xác định. Phân tử ADN được đánh dấu đồng vị phóng xạ P32 ở một đầu tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hình phóng xạ. Xử lí hóa học đặc hiệu phân hủy đặc trưng một loại nucleotide của mạch ADN đã đánh dấu phóng xạ, tạo các đoạn oligonucleotide có chiều dài hơn kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng điện di. Kết qủa các phản ứng hóa học xử lí mạch ADN được phát hiện bằng điện di trên gel polyacriamid có thể xác định được trình tự mạch đơn.
Phương pháp Sanger dựa vào sự tổng hợp enzyme ADN polymerase. Đặc trưng của phương pháp là ngoài 4 loại nucletide thông thường còn sử dụng thêm 4 loại ddNTP (dideoxynucleotide triphosphate gồm 4 loại ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) có nhóm 3’OH được thay thế bằng H. Các ddNTP sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp vì liên kết photphodieste không được hình thành. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn ADN có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn ADN gốc. Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ P32 hay S35 thì sau khi điện di người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật phóng xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn ADN.
Ngày nay, phương pháp xác định trình tự gen chủ yếu được thực hiện bằng máy giải trình tự tự động. Nguyên tắc ban đầu của hai phương pháp hoá học và enzyme được cải tiến và đưa vào các thiết bị tự động hoá, nhanh và chính xác hơn. Phương pháp này kết hợp với kỹ thuật PCR để tổng hợp các oligonucleotide. Trong kỹ thuật này, các ddNTP được đánh dấu bằng các chất huỳnh quang, có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm. Hỗn hợp được phân tích bằng kỹ thuật điện di mao quản và hệ thống phân tích bằng phần mềm máy tính hiện đại, chính xác.
28
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Lựa chọn nhóm nghiên cứu dựa trên những bệnh nhân có biểu hiện bệnh phì đại cơ tim không xác định được nguyên nhân rõ ràng, tình nguyện tham gia nghiên cứu sau khi được giải thích đầy đủ các thông tin có liên quan.
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
Trên cơ sở các biểu hiện không điển hình của bệnh Fabry gặp với tỷ lệ khá lớn ở các bệnh nhân có phì đại thất trái, chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân trong nghiên cứu như sau:
* Tiêu chuẩn chẩn đoán phì đại (cơ) tim:
Bệnh nhân siêu âm tim tại phòng Siêu âm có một trong các tiêu chuẩn sau: - Bề dầy thành sau thất trái thì tâm trương (LVPWd) > 12mm
- Khối lượng cơ thất trái (LVMI): Nam >134g/m2, Nữ >110g/m2.
* Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân không có các tiêu chuẩn trên.
- Bệnh nhân không tình nguyện tham gia nghiên cứu. * Nhóm đối chứng
- Người bình thường không có các tiêu chuẩn trên, không mắc các bệnh liên quan đến tim và không có các đặc điểm của bệnh Fabry.
- Tình nguyện tham gia nghiên cứu
2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu [68]
29 384 ) 2 , 0 . 2 , 0 ( 8 , 0 . 2 , 0 . 96 , 1 . . 2 2 2 2 2 / 1 pq n Trong đó:
là mức ý nghĩa thống kê, lấy giá trị = 0,05.
Z là giá trị giới hạn của phân bố chuẩn với mức ý nghĩa 2 phía của sai lầm ấn định = 1,96.
p=0,2 (p là con số kinh nghiệm dựa vào kết quả nghiên cứu trước đây của Bệnh viện đa khoa cựu chiến binh Đài Bắc về bệnh Fabry)
q = 1 – p
: Sai số được tính bằng 20% của p Thay vào ta được n ≥ 384.
2.3. Nguyên liệu
2.3.1. Mẫu máu
Mẫu phân tích là mẫu máu được lấy theo quy trình thu thập giọt máu khô gồm các bước như sau:
1. Làm hồ sơ bệnh án, photo siêu âm, xét nghiệm. 2. Giải thích bệnh nhân: giới thiệu về nghiên cứu.
3. Phỏng vấn bệnh nhân theo phiếu phỏng vấn ngay sau khi được bệnh nhân đồng ý tham gia.
4. Ghi họ tên, ngày tháng năm sinh của bệnh nhân; ngày lấy máu lên trên giấy thấm DBS (Dry Blood Spot).
5. Lấy 3ml máu tĩnh mạch (chú ý tránh vỡ hồng cầu, không đâm kim lần 2, thay xilanh mới nếu cần chọc kim lại).
30
7. Nhỏ máu lên giấy DBS, để giọt máu tự lan đều xung quanh vòng tròn.
8. Gác lên giá, để khô ở nhiệt độ phòng trong 60-90phút, tối đa 3h (không để giấy trực tiếp trên mặt bàn).
9. Cắm đầu kim 20, cho phần máu còn lại vào ống nghiệm chống đông EDTA. Bảo quản ống máu trong thùng đá khô.
10. Đóng gói các tờ DBS trong túi nilon gắn mép. Cho thêm vào mỗi túi nilon: 5 - 10 gói chống ẩm, 1 giấy ẩm kế. Trải túi nilon trên mặt bàn phẳng, vuốt mạnh để đuổi khí ra khỏi túi, miết cẩn thận mép túi để gắn hoàn toàn miệng túi.
11. Dán nhãn, ghi ngày lấy mẫu. Bảo quản lạnh 40C (ngăn mát tủ lạnh hoặc trong thùng đá khô)
Hình 2.1. Mẫu máu trên giấy thấm DBS
2.3.2. Các loại hóa chất và trang thiết bị
- Máy đo phổ khối song song với cụm 3 khối thiết bị tứ cực Triple Quad LC/MS 6460 (Aligent).
31
- Kít giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) - Máy giải trình tự ABI Prism 3730.
- Bộ điện di ngang.
- Các hoá chất, dụng cụ cần thiết.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp xác đinh hoạt độ enzyme α-galactosidase A
2.4.1.1. Tiến hành phản ứng enzyme
Chuẩn bị đệm phản ứng
Cân 2,45g sodium acetate trihydrate hoà tan vào nước cất. Bổ sung thêm 1,46 ml glacial acetic acid
Điều chỉnh PH về 4,6 bằng acetic acid hoặc sodium hydroxide Bổ sung thêm nước cất đề đưa thể tích dung dịch lên 250 ml
Cuối cùng, trong 250ml đệm phản ứng có 0,174 mol/l acetate, PH 4.6
Chuẩn bị dung dịch phản ứng
- Cơ chất (substrate – S): (6-Benzoylamino-hexyl)-{2-[4-(3,4,5-trihydroxy-6- hydroxymethyl-tetrahydro-pyran-2-yloxy)-phenylcarbamoyl]-ethyl}-carbamic acid
tert-butyl ester (C33H47N3O10)
- Nội chuẩn (internal standard – IS): (6-d5-benzoylamino-hexyl)-[2-(4- hydroxy-phenylcarbamoyl)-ethyl]-carbamic acid tert-butyl ester (C27H32N5O5D5)
(Cơ chất và nội chuẩn do Genzyme cung cấp)
- Hoà cơ chất và nội chuẩn (S/IS) theo tỉ lệ 500:1. Bổ sung 0,45ml dung dịch sodium taurocholate 120g/l vào S/IS và votex nhẹ.
- Thêm vào 14,67ml đệm, 2,88ml N-Acetylgalactosamine (GALNAc] 1mol/l và votex nhẹ ta được dung dịch phản ứng.
32
Bảng 2.1. Các thành phần có trong dung dịch phản ứng
Cơ chất (S) 3,33 mmol/l
Nội chuẩn (IS) 6,67 µmol/l
sodium taurocholate 3g/l
GALNAc 160 mmol/l
sodium acetate 0,142 mol/l
PH 4.6
Phản ứng enzyme
Đục 3,2 mm đường kính giấy DBS và đặt vào ống.
Cho vào ống 70 µl sodium phosphate PH 7,1. Ủ lắc 60 phút ở 37oC (875 rpm). Sau 1 h lấy mẫu ra và đem ly tâm 2000g trong 1 phút.
Lấy 10 µl dịch nổi cho vào ống đã có sẵn 15µl dung dịch phản ứng. Ủ lắc ở 37oC trong 24h (225 rpm). Dừng phản ứng bằng cách dùng 100 µl ethyl acetate (EA): Methanol (MeOH) tỷ lệ 1:1.
33
2.4.1.2. Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp đo khối phổ
Quá trình đo MS/MS được thực hiện trên máy đo phổ khối song song với khối thiết bị ba tứ cực Triple Quad LC/MS 6460 (Aligent) sử dụng phần mềm Agilent MassHunter Quantitative Analysis.
Trước khi đo khối phổ, mẫu được chạy sắc ký lỏng hiệu năng siêu cao UPLC. Pha động gồm có dung môi A (H2O, 0,1% acid formic) và dung môi B (50% acetonitrile, 50% methanol, 0,1% acid formic). 30 µl mẫu được tiêm tự động, tốc độ dòng chảy là 200 µl/ phút với hệ thống UPLC Agilent 1290. Một cột C18 BEH (50 mm x 2,1 mm) với các hạt 1,7 m. Nhiệt độ cột là 400
C. Tổng thời gian chạy LC – MS/MS cho 1 mẫu là 3 phút. Các thông số đo khối phổ được ghi trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các thông số trong phương pháp khối phổ
Thiết bị Triple Quad LC/MS 6460 (Aligent)
ES Source ES+
Source Temp 1500C
CAD Gas 4
Curtain gas 12 psi
Gas 1 12 psi
Gas 2 42 psi
Ion Sprav Voltage 4500 V
Declustering Potential 20V
Collision Cell Exit Potential 20V
Compound MRM CE (eV) EP (V) Dwell time (mS)
GLA – IS 489.30>389.30 20 7 100
34
Hoạt độ được tính bằng lượng sản phẩm thu được chia cho lượng máu sử dụng và thời gian ủ trừ đi hoạt độ trung bình của mẫu trống. Mẫu trống là mẫu từ phản ứng của 3,2 mm đường kính giấy không chứa máu, các bước tiến hành giống với mẫu DBS. Chúng ta coi như trong 3,2 mm đường kính DBS có 3,2 µl máu toàn phần. Thời gian phản ứng là 24h.
Hoạt độ enzyme được tính theo công thức:
Ae = {(P/IS) x [IS] x V}/(3,2 x ti)
Ae : là hoạt độ enzyme được tính theo đơn vị µmol/h/L máu toàn phần. P/IS: là tỉ lệ thu được từ dữ liệu đo MS/MS.
IS: là nồng độ của nội chuẩn tính bằng µmol/l V: là thể tích dung dịch phản ứng tính bằng µl.
ti : là thời gian ủ tính bằng giờ.
2.4.2. Phân tích trình tự gen GLA
2.4.2.1. Khuếch đại gen GLA từ mẫu máu toàn phần
- Mẫu máu sẽ được lấy từ những bệnh nhân đã được lựa chọn, máu được thu thập vào trong ống có chứa ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA).
- Các mẫu được lựa chọn phân tích trình tự gen GLA là các mẫu có hoạt độ enzyme thấp nhất (<20% hoạt độ enzyme bình thường)
- ADN sẽ được phân lập từ máu toàn phần.
- Các phân đoạn của gen GLA sẽ được khuếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR) sử dụng các cặp mồi thích hợp.
a) Tinh sạch ADN
Vật liệu và hóa chất:
35
- Đệm ly giải: 320mM sucrose; 10mM Tris – HCl pH 7,5; 5mM MgCl2; 1% (v/v) Triton X -100.
- Dung dịch pro K: 60µg/ml proteinase K. Dung dịch EDTA 10mM
- Đệm PBND (PCR Buffer with Nonionic Detergents): 10mM Tris- HCl pH 8,3; 2,5mM MgCl2; 50mM KCl; 0,1mg/ml gelatin; 0,45% (v/v) Nonidet P40; 0,45% (v/v) Tween 20; khử trùng và hòa gelatin; bảo quản đông lạnh. Bổ sung Pro K trước khi dùng.
Tiến hành
1. Thu 65 - 100µl máu qua ống dẫn vi mao đã tráng heparin vào ống eppendorf 1,5ml chứa 20 µl dung dịch EDTA. Hòa ngay để chống đông. Bảo quản ở nhiệt độ lạnh trước khi dùng.
2. Bổ sung 200 µl đệm ly giải vào mỗi ống và lắc rung. Ly tâm 25 giây với 25.000 vòng/phút để tủa genome. Gạn bỏ dịch nổi và làm lại bước này 2 – 4 lần cho đến khi không còn hemoglobin.
3. Hòa tủa genome vào 100 µl PBND với 60 µg/ml pro K và ủ 60 phút ở 550C. Hâm nóng mẫu lên 970C trong 10 phút để bất hoạt Pro K.
b) Phản ứng PCR
Vật liệu và hóa chất:
- Dung dịch mồi (do trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, bệnh viện đa khoa cựu chiến binh Đài Bắc cung cấp - Bảng 2.3)
- Đệm 10X PCR.
- Taq pol: Taq polymerase - Dung dịch MgCl2 15mM
- Hỗn hợp dNTP: 2,5mM mỗi loại
36
Bổ sung 1 - 5 µl dung dịch ADN vào hỗn hợp PCR chứa: 2,5 µl đệm 10x PCR; 1,5µl MgCl2; 2 µl hỗn hợp dNTP; 0,5 µl mồi xuôi; 0,5 µl mồi ngược; 0,1 µl Taq polymerse, bổ sung H2O cho tổng dung dịch PCR bằng 25 µl.
Chạy PCR theo chu trình nhiệt trong bảng 2.4.
Bảng 2.3. Trình tự và nhiệt độ bắt cặp của mồi, kích thước sản phẩm PCR
Tên cặp mồi
Trình tự nucleotide của mồi Kích thước
sản phẩm
Nhiệt độ bắt cặp
GLA 1F 5’ GTT GCC AGA GAA ACA ATA ACG 3’
391 bp 630C
GLA 1R 5’ GTT GAG ACT CTC CAG TTC CCC 3’
GLA 2F 5’ ATG GGA GGT ACC TAA GTG TTC 3’
312 bp 620C
GLA 2R 5’ GAG GGC TGT TTC TAA AC AAG C 3’
GLA 3F 5’ GGT GAC TCT TTT CCT CCC TCT 3’
281 bp 630C
GLA 3R 5’ TTG GTT CTT TGG CTC AGC TAC 3
GLA 4F 5’ TAT AGC CCC AGC TGG AAA TTC 3'
241 bp 620C
GLA 4R 5’ GTT GGA CTT TGA AGG AGA CCT T 3’
GLA 5,6F 5’ GAA GGC TAC AAG TGC CTC CT 3’
970 bp 600C
GLA 5,6R 5’ GAG AGA GGT CGT TCC CAC AC 3’
GLA 7F 5’ TCA AGC CAA AGC TCT CCT TC 3’
695 bp 610C
GLA 7R 5’ TGG AGA AAA AGG TGG ACA G 3’
IVS4F 5’ TCT GTC CCT CAA CAC TGC AA 3’
445 bp 600C
IVS4R 5’ TAG GCA GGT GGG ATA TCA GG 3’
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR
Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ
940C 2 phút 1 940C 30 giây 35 60-630C 30 giây 720C 1 phút 720C 1 phút 1 40C Bảo quản
37
2.4.2.2. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Sản phẩm phản ứng PCR sẽ được phân tích qua điện di trên gel agarose 1,5% sau đó tách ADN mong muốn ra khỏi gel bằng phương pháp thôi gel.
Vật liệu và hóa chất:
- Hỗn hợp PCR
- Đệm 50x TAE: 2M Tris Base; 2M acid acetic tinh khiết; 50mM EDTA pH 8,0 - Đệm nạp gel 6x: 30% (v/v) glycerol; 0,25 % (w/v) bromophenol blue; 0,25 % (w/v) xylene cyanol FF. Bảo quản ở 40C.
Các bước thao tác
- Cân một lượng agarose bổ sung vào thể tích 1x TAE thích hợp. Chuẩn bị bản gel và buồng điện di (bổ sung một lượng EtBr thích hợp trước khi đúc gel).
- Trộn 5x thể tích sản phẩm PCR với 1x thể tích đệm nạp. Nạp mẫu vào giếng gel cùng thang chỉ thị.
- Bật nguồn điện 100V, chạy điện di 30 phút đồng thời quan sát sự di chuyển của mẫu. Chụp ảnh gel dưới ánh sáng cực tím.
2.4.2.3. Tách ADN từ gel Agarose
Để thực hiện được bước giải trình tự các đoạn ADN đã được nhân lên từ phản ứng PCR, điều đầu tiên và cũng rất quan trọng đó là phải tinh sạch được ADN và đảm bảo duy nhất chỉ có 1 ADN là sản phẩm PCR. Do đó chúng tôi lựa chọn phương pháp điện di và tinh sạch ADN từ gel agarose bằng kit tinh sạch của Armesco.
Các bước thao tác
- Cắt mảnh agarose có băng ADN quan tâm (≤ 200mg) bỏ vào ống ly tâm - Bổ sung 0,5 ml đệm cố định (Binding buffer) và ủ ở 550
C trong 5 phút để làm tan mảnh gel.
38
- Cài cột Spin vào ống Collection, chuyển dung dịch chứa ADN vào cột Spin, ly tâm 25000 vòng/phút trong 30 giây.
- Tháo cột spin và loại bỏ dung dịch trong ống Collection. Lắp lại cột và bổ sung 700 µl dung dịch rửa giải (washing solution) vào cột spin, ly tâm 25000 vòng/phút trong 30 giây
- Tháo cột spin và loại bỏ dung dịch trong ống Collection. Lắp lại cột và ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút để loại bỏ ethanol còn lại.
- Tháo cột spin và lắp vào ống ly tâm mới (1,5 – 1,7 ml), bổ sung 30 – 50 µl đệm TE. Rửa giải ADN khỏi cột bằng cách ly tâm 25000 vòng/phút trong 30 giây. Bảo quản dung dịch chứa ADN ở - 200
C.
2.4.2.4. Định lượng ADN trong dung dịch bằng phương pháp quang phổ kế
Quang phổ kế không phải là phương pháp cho kết quả định lượng chính xác nhất, nhưng chúng ta có thể ước lượng nồng độ ADN tương đối trong mẫu.
Phương pháp này dựa vào sự hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 260nm và