Trình tự gen GLA được xử lý bằng cách sử dụng kít giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) và máy giải trình tự ABI Prism 3730. Hệ thống giải trình tự này hoạt động dựa trên nguyên tắc chung của phương pháp Sanger. Sản phẩm tinh sạch sẽ được tiến hành PCR giải trình tự (cycle sequencing) sử dụng kít giải trình tự chu kỳ BigDye Terminator v3. Kit này đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết cho phản ứng nhân gen để đọc trình tự như ddNTP; dNTP; ADN polymerase… Do đó chỉ cần bổ sung thêm ADN khuôn là sản phẩm đã tinh sạch và mồi. Phản ứng được thực hiện trong một ống vì 4 loại ddNTP đã được đánh dấu bằng các màu khác nhau. Bảng 2.5. Thành phần của phản ứng nhân bản. Thành phần Số lƣợng Mồi 3,2 pmol ADN khuôn Bảng 2.6 BigDye 8 µl H2O Cho đủ 20 µl
Bảng 2.6. Hàm lượng ADN khuôn cho phản ứng PCR giải trình tự
ADN khuôn Số lƣợng 100 – 200 bp 1 - 3 ng 200 – 500 bp 3 – 10 ng 500 – 1000 bp 5 – 20 ng 1000 – 2000 bp 10 – 40 ng > 2000 bp 20 – 50 ng
40
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR giải trình tự.
Nhiệt độ (0
C) Thời gian Chu kỳ
960C 1 phút 1 960C 10 giây 25 500C 5 giây 600C 4 phút 40C Bảo quản
Sảm phẩm PCR giải trình tự được làm sạch bằng phương pháp Ethanol/EDTA của hãng Applied BioSysterms cũng cấp. Quy trình thực hiện gồm các bước sau:
-Cho vào mẫu 60µl ethanol 100%, 5 µl EDTA 125mM và trộn nhẹ. -Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút.
-Ly tâm 12000 vòng trong 15 phút ở 40C. Loại dịch nổi và làm khô cặn. -Hoà tan nhẹ sản phẩm đã làm sạch bằng 15µl Hi-Di Formamine do hãng cung cấp.
Sau đó mẫu được đưa vào các giếng của ống điện di mao quản 80cm x 50 µm chứa POP – 6TM
của hãng ABI, Mỹ. Vùng gen GLA được xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI Prism 3730 và xử lý bằng phần mềm chuyên dụng.
41
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả xác định hoạt độ enzyme α-Gal A
3.1.1. Hoạt độ enzyme α-Gal A
Hình 3.1. Hoạt độ enzyme α- Gal A của bệnh nhân phì đại cơ tim
Chúng tôi tiến hành đo hoạt độ enzyme của 421 mẫu lấy từ các bệnh nhân phì đại cơ tim. Từ kết quả trên hình 3.1 cho thấy khoảng hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm bệnh nhân phì đại cơ tim từ 0.17 – 9.18 µmol/h/L. Hoạt độ đo được chủ yếu nằm trong khoảng từ 0.5 – 3.0 µmol/h/L. Trong số 421 mẫu, 4 mẫu có hoạt độ < 0.5 µmol/h/L, 226 mẫu (chiếm 54%) có hoạt độ enzyme từ 1.0 – 2.0 µmol/h/L. Chỉ có 7 mẫu có hoạt độ enzyme từ 4.0 – 7.0 µmol/h/L, và >7.0 chỉ có duy nhất một mẫu có hoạt độ bằng 9.18 µmol/h/L. Có tới 90% số mẫu có hoạt độ enzymeα-Gal A nhỏ hơn 2.93 µmol/h/L. Giá trị mean ± SD của hoạt độ enzyme α-Gal A ở nhóm bệnh nhân này là 1.84 ± 0.93 µmol/h/L.
42
Kết quả này có sự khác biệt so với một số nghiên cứu trước đó trên thế giới. Năm 1995, Nakao và cộng sự đã sàng lọc bệnh Fabry trên 230 bệnh nhân nam phì đại cơ thất trái, hoạt độ enzyme của nhóm bệnh nhân này từ 4.5 – 17.6 nmol/h/mL (mean ± SD bằng 8.5 ± 2.4) [55]. Năm 2002, B. Sachdev và cộng sự cũng đã sàng lọc bệnh Fabry dựa vào hoạt độ enzyme α-Gal A trên 147 bệnh nhân nam phì đại cơ tim khởi phát muộn, kết quả cho thấy hoạt độ enzyme của nhóm bệnh nhân này từ 2.3 – 25 nmol/h/mL (mean ± SD bằng 7.4 ± 2.7) [11]. Các kết quả này cao hơn nhiều so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi. Điều này có thể do phương pháp xác định hoạt độ enzyme α-Gal A khác nhau. Nhóm nghiên cứu của Nakao và B. Sachdev đã sử dụng phương pháp đo huỳnh quang chuẩn với cơ chất là 4- methylumbelliferyla-D-galactopyranoside (Sigma) để xác định hoạt độ enzyme α- Gal A. Theo nghiên cứu của Liao và cộng sự năm 2014, phương pháp xác định hoạt độ một số enzyme trong đó có enzyme α-Gal A bằng sắc ký lỏng kết hợp đo khối phổ song song (LC – MS/ MS) ưu việt và cho kết quả chính xác hơn phương pháp đo huỳnh quang [43].
Chúng tôi tiến hành xác định hoạt độ enzyme của 30 người bình thường làm nhóm đối chứng (nhóm đối chứng được lựa chọn dựa trên tiêu chuẩn nêu trong mục 2.1.2.). Hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm đối chứng từ 5.32- 13.21 µmol/h/L, giá trị mean ± SD là 8.9 ± 2.2 µmol/h/L. Như vậy trong số 421 mẫu lấy từ các bệnh nhân phì đại cơ tim chỉ có 3 mẫu có hoạt độ enzyme α-Gal A tương đương người bình thường, 90% số mẫu của bệnh nhân có hoạt độ nhỏ hơn 2.93 µmol/h/L (≤ 33% hoạt độ bình thường), 10% số mẫu có hoạt độ nhỏ hơn 0.91µmol/h/L (≤ 10% hoạt độ bình thường). Điều này cho thấy các bệnh nhân phì đại cơ tim trong nghiên cứu đều có hoạt độ enzyme α-Gal A suy giảm hoặc suy giảm mạnh.
43
Hình 3.2. Hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm đối chứng và bệnh nhân.
Giá trị hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm đối chứng tương ứng với các kết quả của một số nghiên cứu trên thế giới. Angéla Dajnoki và cộng sự đã sàng lọc bệnh Fabry ở trẻ sơ sinh bằng phương pháp MS/MS. Kết quả đo hoạt độ enzyme α- Gal A ở 5025 bé trai là 9.85 ± 6.4 µmol/h/L, và ở 4677 bé gái là 10.2 ± 6.3 µmol/h/L [10]. Trong nghiên cứu của C. Ronald Scott và cộng sự trên 108 905 trẻ sơ sinh, hoạt độ trung bình của enzyme α-Gal A bằng 10.2 µmol/h/L [18].
44
Tuy nhiên, hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm bệnh nhân phì đại cơ tim so với nhóm người bình thường trong nghiên cứu của chúng tôi có sự khác biệt so với một số nghiên cứu khác. Trong nghiên cứu của Nakao và cộng sự trên đối tượng bệnh nhân nam phì đại cơ tim, hoạt độ enzyme α-Gal A của nhóm người bình thường là 8.4 ± 2.4 nmol/h/mL. Trong số 223 bệnh nhân phì đại cơ tim, chỉ có 7 bệnh nhân (3%) có hoạt độ emzyme α-Gal A thấp bất thường (0.4 – 1.2 nmol/h/mL, ≤ 14% giá trị hoạt độ bình thường). Các bệnh nhân còn lại đều có giá trị hoạt độ enzyme bình thường [55]. Năm 2002, B. Sachdev và cộng sự nghiên cứu xác định cứu tỷ lệ bệnh Fabry trên bệnh nhân nam phì đại cơ tim khởi phát muộn. Trong số 153 bệnh nhân, chỉ có 6 bệnh nhân (4%) có hoạt độ enzyme α-Gal A thấp bất thường (từ 0.1 – 0.7 nmol/h/mL, ≤ 8.3 % giá trị hoạt độ bình thường) [11].
Do ở Việt Nam chưa từng có một công trình nghiên cứu sàng lọc nào về enzyme α-Gal A nên chúng tôi không có khoảng giá trị tham chiếu về hoạt độ enzyme này ở người Việt Nam để so sánh. Chúng tôi sử dụng khoảng giá trị tham chiếu của người Đài Loan do trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, bệnh viện cựu chiến binh Đài Bắc cung cấp. Đây là trung tâm hàng đầu châu Á và trên thế giới nghiên cứu về bệnh hiếm gặp trong đó có bệnh Fabry. Giá trị tham chiếu về hoạt độ enzyme α-Gal A khảo sát trên đối tượng phì đại cơ tim ở Đài loan sử dụng phương pháp LC – MS/ MS là 2.05 – 7,46 µmol/h/L. Trong khi đó dải tham chiếu của 421 mẫu trong nghiên cứu này là 0.91 – 2.93 µmol/h/L.
Khi so sánh hai dải tham chiếu cho thấy hoạt độ enzyme α-Gal A trong nghiên cứu này thấp hơn so với dải tham chiếu của người Đài Loan. Điều này có thể do các đột biến gen, quy trình bảo quản mẫu và thao tác thí nghiệm hoặc cũng có thể do dải tham chiếu của người Việt Nam thấp hơn. Chúng tôi đã cho kiểm định quy trình bảo quản mẫu và thao tác thí nghiệm bằng cách gửi mẫu sang trung tâm nghiên cứu và điều trị bệnh hiếm gặp, bệnh viện đa khoa cựu chiến binh Đài Bắc kiểm chứng. Kết quả cho thấy quy trình bảo quản mẫu và thao tác thí nghiệm không có gì sai sót. Như vậy, chưa thể khẳng định dải tham chiếu hoạt độ enzyme α-Gal A trong nghiên cứu này thấp hơn của Đài Loan là do hoạt độ enzyme α-Gal A của người Việt Nam
45
nói chung thấp hay vì nguyên nhân khác. Cần có những nghiên cứu mở rộng hơn nữa, trên số lượng đối tượng lớn hơn để có thể khẳng định.
3.1.2. Số lượng mẫu và hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.3. Số lượng mẫu theo nhóm tuổi
Từ hình 3.3 cho ta thấy bệnh nhân mắc phì đại cơ tim chủ yếu có nhóm tuổi từ 40 đến 80 tuổi. Trong số 421 bệnh nhân có 86 bệnh nhân (khoảng 20%) có độ tuổi từ 40 – 49 tuổi, 138 bệnh nhân (khoảng 33%) có tuổi từ 50 - 59 tuổi, 96 bệnh nhân (khoảng 23%) có độ tuổi từ 60 - 69 tuổi. Như vậy, có tới 76% bệnh nhân có độ tuổi từ 40 đến dưới 70 tuổi. Điều này có thể cho thấy rằng bệnh phì đại cơ tim có liên quan đến hoạt động của enzyme α-Gal A là bệnh khởi phát muộn, bệnh chủ yếu biểu hiện ở nhóm tuổi trung niên (trên 40 tuổi) trong đó rõ ràng nhất là từ 50 đến 60 tuổi. Giá trị mean ± SD về độ tuổi của nhóm bệnh nhân là 57 ± 12. Kết quả này tương đối phù hợp với một số nghiên cứu trước đó về sàng lọc bệnh Fabry ở bệnh nhân phì đại cơ tim trên thế giới. Năm 1995, Nakao và cộng sự nghiên cứu trên 230 bệnh nhân phì đại cơ tim độ tuổi từ 16 đến 87 tuổi, giá trị mean ± SD là 62 ± 13 tuổi [55]. Trong nghiên cứu của Ole Havndrup và cộng sự năm 2010 sàng lọc những
46
bệnh nhân bị bệnh Fabry từ nhóm bệnh nhân phì đại cơ tim chỉ ra rằng, nhóm tuổi bị bệnh phì đại cơ tim không do đột biến sacrcommer nằm trong khoảng 40 – 60 tuổi (mean ± SD là 53 ± 15 tuổi, độ tuổi của bệnh nhân từ 5 – 77 tuổi), trong đó chủ yếu tập trung ở nhóm tuổi từ 50 -59 tuổi (khoảng 34%) [57]. Một cuộc khảo sát khác của Albert A Hagege và cộng sự năm 2010 tại Pháp về bệnh Fabry trên đối tượng phì đại cơ tim (LVPWd ≥ 15mm) cũng cho thấy, trong số 392 bệnh nhân được khảo sát có độ tuổi từ 18 – 79 tuổi thì các bệnh nhân chủ yếu tập trung vào nhóm tuối 50 – 59 tuổi (giá trị mean ± SD là 53 ± 14 tuổi) [6].
Hình 3.4. Hoạt độ enzyme α-Gal A theo nhóm tuổi
Từ hình 3.4 chúng ta thấy hoạt độ enzyme α-Gal A trung bình theo nhóm tuổi chênh lệch không nhiều. Điều này cho thấy rằng độ tuổi không ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme. Hoạt độ enzyme cao hay thấp tuỳ thuộc vào tình trạng từng bệnh nhân. Độ tuổi từ 20 – 30 tuổi có hoạt độ enzyme thấp có thể là do số lượng mẫu ít, không đủ điều kiện để khẳng định hoạt độ enzyme nhóm tuổi này suy giảm vì độ tuổi.
47
3.2. Kết quả giải trình tự gen GLA
3.2.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự Bảng 3.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự Bảng 3.1. Đặc điểm của 26 mẫu được giải trình tự
Kí hiệu mẫu Giới tính Hoạt độ enzyme GLA Tuổi LVMI (g/m2) LVPWd (mm) FB01 Nữ 1.79 75 135.00 11.00 FB02 Nam 1.40 81 221.00 16.30 FB03 Nam 0.89 78 174.00 9.60 FB04 Nam 1.59 80 169.00 13.00 FB05 Nam 2.13 29 150.00 14.60 FB06 Nữ 1.52 80 142.00 10.40 FB07 Nữ 1.92 59 140.00 11.00 FB08 Nữ 1.61 73 151.00 13.60 FB09 Nữ 2.62 65 134.00 11.10 FB10 Nữ 1.46 59 128.00 11.90 FB26 Nam 0.54 21 145.00 10.30 FB44 Nam 0.47 58 117.00 13.00 FB64 Nam 0.17 56 205.00 22.60 FB69 Nam 0.53 60 237.00 14.90 FB70 Nam 0.61 74 212.00 13.00 FB74 Nam 0.54 72 172.00 14.30 FB79 Nam 0.52 56 167.00 14.00 FB80 Nam 0.61 76 151.00 10.20 FB84 Nam 0.50 52 135.00 9.60 FB85 Nam 0.32 75 159.00 14.00 FB133 Nam 0.32 60 146.00 9.40 FB331 Nam 0.80 48 129.00 14.30 FB334 Nam 1.11 41 146.00 12.50 FB345 Nam 1.17 43 170.00 15.80 FB378 Nam 0.99 50 165.00 12.00 FB414 Nam 1.01 48 147.00 17.00
48
Các mẫu được lựa chọn để giải trình tự là các mẫu có hoạt độ enzyme thấp nhất trong các đợt phân tích. Trong số 26 mẫu được giải trình tự có 20 mẫu của nam và 6 mẫu của nữ. Hoạt độ enzyme nằm trong khoảng từ 0.17 – 2.62 µmol/h/L, giá trị mean ± SD là 1.04 ± 0.64 µmol/h/L (≤ 10% giá trị hoạt độ bình thường). Độ tuổi của nhóm bệnh nhân này từ 21 – 81 tuổi.
Các chỉ số về cơ tim gồm có chỉ số khối lượng cơ thất trái (LVMI) và chỉ số bề dày thành sau thất trái thì tâm trương (LVPWd). Hai chỉ số này là hai chỉ số quan trọng nhất trong đánh giá phì đại cơ tim trên bệnh nhân. Do tâm thất trái là buồng bơm chính của tim đưa máu đi nuôi cơ thể nên có hoạt động trao đổi chất và vận động cơ học nhiều nhất. Đây là nguyên nhân khi sàng lọc các bệnh nhân phì đại cơ tim thì chỉ số LVMI và LVPWd rất quan trọng.
Chỉ số LVMI và LVPWd của người bình thường và bệnh nhân phì đại cơ tim được trình bày trong bảng 3.2. Bệnh nhân được lựa chọn nghiên cứu là những bệnh nhân có một trong hai hoặc cả hai chỉ tiêu LVMI và LVPWd bất thường.
Bảng 3.2. Các chỉ số LVMI, LVPWd của người bình thường và bệnh nhân phì đại cơ tim.
Như vậy, trong số 26 mẫu lấy từ các bệnh nhân phì đại cơ tim có hoạt độ enzyme α-Gal A suy giảm mạnh, 23 mẫu có khối lượng cơ thất trái ≥ 134 g/m2 (chiếm 88.46%), 16 mẫu có bề dày thành sau thất trái thì tâm trương ≥ 12 mm (chiếm 61.54%). Điều này thêm phần khẳng định rằng tâm thất trái là phần dễ bị phì đại nhất của tim và hoạt động bất thường của enzyme α-Gal A là nguyên nhân chính hoặc một trong số các nguyên nhân gây phì đại cơ tim ở nhóm bệnh nhân này.
Tiêu chí LVMI (g/m2) LVPWd (mm) Nam Nữ
Người bình thường 100.77 ± 19.96 86.34 ± 16.87 7 ±1 Bệnh nhân phì đại cơ tim ≥ 134 ≥ 110 ≥ 12
49
3.2.2. Kết quả nhân bản các phân đoạn gen GLA
Theo thống kê, tính đến năm 2010 đã phát hiện khoảng 600 biến đổi trong trình tự gen GLA gây bệnh Fabry. Các đột biến được tìm thấy không nằm ở vị trí nhất định (hot spot) mà có thể ở bất cứ vị trí nào trên 7 exon của gen [23]. Ngoài ra, một số nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra đột biến IVS4 +919 G>A, một đột biến ở intron 4 xuất hiện với tần số khá cao (có thể lên tới 1/1600 trẻ sơ sinh). Đột biến này chủ yếu gặp ở khu vực châu Á như Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và được xác định là có thể ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme α – Gal A và có liên quan đến bệnh tim khởi phát muộn [30, 34, 44, 69]. Do đó, chúng tôi đã lựa chọn nhân bản và xác định trình tự 7 exon và 1 đoạn intron 4 để phát hiện bất thường ở gen GLA của một số mẫu có hoạt độ enzyme α – Gal A suy giảm mạnh.
3.2.2.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR
Sau khi nhân bản ADN bằng phản ứng PCR 7 exon, 1 đoạn intron để thực hiện bước tiếp theo là giải trình tự các đoạn ADN được nhân lên từ phản ứng PCR, điều trước tiên và cũng rất quan trọng đó là làm sạch các đoạn ADN này. Chúng tôi lựa chọn phương pháp điện di trên gel agarose và thôi băng ADN cần thiết từ gel agarose. Phương pháp điện di và thôi băng đã được trình bày ở phần phương pháp.
Dưới đây là hình ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu.
50
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm PCR 7 exon và intron 4 của mẫu FB26, FB44; FB64; FB69 M: Marker 100 bp 1: Mẫu FB26 2: Mẫu FB44 3: Mẫu FB64 4: Mẫu FB69 695 bp 445 bp
51
Từ hình ảnh điện di cho thấy, sản phẩm PCR thể hiện trên băng rất gọn, rõ,