E.coli phân lập ựược bằng phương pháp PCR
Có rất nhiều phương pháp có thể dùng ựể xác ựịnh ựộc tố ựường ruột (Enterotoxin) và kháng nguyên bám dắnh (Fimbriae) của vi khuẩn E.coli. Hiện nay, người ta dùng phương pháp PCR ựể xác ựịnh các loại ựộc tố và kháng nguyên bám dắnh, ựây là phương pháp ưu việt nhất về ựộ nhạy và tắnh chắnh xác.
- Nguyên tắc của phương pháp PCR:
Tất cả các DNA Polymerase khi hoạt ựộng tổng hợp 1 mạch DNA mới từ mạch khuôn ựều cần có sự hiện diện của những mối chuyền riêng biệt. Mồi là những ựoạn DNA ngắn, có khả năng bắt căp bổ sung với một ựầu của mạch khuôn và DNA Polymerase sẽ nối dài mồi ựể hình thành mạch mới. Phương pháp PCR ựã ựược hình thành dựa vào ựặc tắnh ựó của các DNA Polymerase. Vì vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyền riêng biệt bắt cặp bổ sung với hai ựầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp ựựoc ựoạn DNA nằm giữa hai mối ựó. điều ựó có nghĩa là ựể khuếch ựại một
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 trình tự DNA xác ựịnh, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự ựó ựủ ựể tạo ra các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm có mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer). Từ xuôi và ngược ựược hiểu là xuôi và ngược với chiều phiên mã của gen.
* Cách tiến hành:
- DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37ồC / 24h.
- Hỗn hợp phản ứng PCR gồm:
Primers: 1ộl mỗi loại
Dung dịch ựêm (5X): 5.0 ộl. Enzyme (Taq Polyméae): 0.05 ộl.
Nước khử ion vừa ựủ ựể ựạt chuẩn thể tắch cuối cùng là 25 ộl cho 1 phản ứng.
- Chu trình của phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và ựược thực hiện trong máy nhân gen tự ựộng Perkin Elmer, theo sơ ựồ sau :
Chu trình
thứ nhất 30 chu trình tiếp theo
Chu trình cuối Yếu tố gây bệnh Biến tắnh (ồC/phút) Biến tắnh (ồC/phút) Gắn mồi (ồC/phút) Tổng hợp (ồC/phút) Tổng hợp (ồC/phút) Sta, Stb, LT 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F4, F5, F6 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F41, F18 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7
- Chạy ựiện di : sản phẩm PCR thu ựược sau khi chu trình phản ứng ựược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye) ) với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên thạch agarose 2%
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 trong dung dịch ựệm TAE (Tris - Acetic - EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong vòng 40 phút. đây là cách ựể cho các ựoạn acid hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tắnh thì tắch ựiện âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi ựặt chúng vào ựiện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tắch trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kắch thước sẽ chuyển dịch với tốc ựộ khác nhau: Loại phân tử có kắch thước lớn chạy chậm, loại có kắch thước bé chuyển dịch nhanh hơn.
- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm màu bằng chất nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (Bet 1 ộl/ml) trong vòng 15phút. Bet là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trắ cố ựịnh của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử Bet tự do.
- đọc kết quả : Bằng cách quan sát dưới ánh ựèn UV (300mm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền ựen, các ựoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng vào thể chụp ảnh ựược và ghi nhận lại. Kắch thước các băng DNA ựược so sánh với DNA chuẩn (DNA maker), ựược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác ựịnh ựược ựộ dài của ựoạn thẳng PCR.