Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli

Vi khuẩn E.coli ựược phân lập và giám ựịnh theo quy trình, có thể tóm tắt như sau:

Bệnh phẩm

(phân, phủ tạng của lợn con bị tiêu chảy)

Thạch MacConkey 37ồC, 20 -24 giờ Thạch máu 37ồC, 20 -24 giờ Nước thịt thường 37ồC, 20 -24 giờ

Chọn khuẩn lạc nghi là vi khuẩn E.coli

Kiểm tra hình thái

Kiểm tra ựặc tắnh sinh hóa: - Sinh Indol

- Lên men ựường

- Di ựộng

Xác ựịnh một số yếu tố gây bệnh bằng PCR

Xác ựịnh Serotype ^{Xác ựịnh tắnh mẫn cảm}

kháng sinh Serotype

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 37

3.4.4. Phương pháp giám ựịnh một số ựặc tắnh sinh hóa chủ yếu của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập ựược

* Phản ứng sinh Indol:

- Nguyên lý: trong môi trường không có ựường mà chỉ có Pepton, một số vi khuẩn sản sinh men Trytophantaza làm phân giải axit amin Tryptophan ựể sinh Indol.

- Cách tiến hành: cấy vi khuẩn vào môi trường Tryton, bồi dưỡng tủ ấm 37ồC trong 24 giờ, lấy ra rồi nhỏ vào môi trường 5 - 6 giọt dung dịch KovacỖs, quan sát trong vòng 1 phút.

- đánh giá kết quả:

+ Phản ứng dương tắnh: trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng tròn màu ựỏ.

+ Phản ứng âm tắnh : môi trường không chuyển màu.

* Phản ứng lên men sinh hơi ựường:

- Thành phần của dung dịch Pepton: Pepton: 15g

Nước cất vô trùng: 1000 ml pH = 7,2 - 7,4.

- Cách tiến hành:

Trong 100 ml môi trường Pepton cho vào 1 ml chỉ thị màu Andrader, lắc ựều rồi chia ra các ống nghiệm. Mỗi ống có 5 ml có ống Durham (ựể kiểm sinh hơi của vi khuẩn).

Pha các loại ựường Glucoza, LactozaẦthành dung dịch 10%, hấp ướt 110ồC trong vòng 20 - 30 phút.

Cho vào mỗi ống môi trường nước Pepton 5 - 6 giọt dung dịch ựường 10%, 20%. để tủ ấm 37ồC trong 24 giờ ựể kiểm tra nếu có tạp khuẩn thì loại

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38 bỏ và thay thế bằng môi trường khác. Sau ựó cấy vi khuẩn cần giám ựịnh vào, rồi bồi dưỡng ở nhiệt ựộ 37ồC trong 24 giờ.

- đánh giá kết quả : cùng lúc kiểm tra ựược 2 tắnh chất:

* Phản ứng lên men ựường:

- Phản ứng dương tắnh: môi trường chuyển thành màu hồng ựỏ. - Phản ứng âm tắnh: môi trường không chuyển màu.

* Phản ứng sinh hơi:

- Phản ứng dương tắnh: ống Durham bị ựẩy lên và trong ống có một khoảng khắ.

- Phản ứng âm tắnh: ống Durham vẫn ở ựáy ống nghiệm, trong ống không có gì.

3.4.5. Phương pháp xác ựịnh các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập ựược bằng phương pháp PCR E.coli phân lập ựược bằng phương pháp PCR

Có rất nhiều phương pháp có thể dùng ựể xác ựịnh ựộc tố ựường ruột (Enterotoxin) và kháng nguyên bám dắnh (Fimbriae) của vi khuẩn E.coli. Hiện nay, người ta dùng phương pháp PCR ựể xác ựịnh các loại ựộc tố và kháng nguyên bám dắnh, ựây là phương pháp ưu việt nhất về ựộ nhạy và tắnh chắnh xác.

- Nguyên tắc của phương pháp PCR:

Tất cả các DNA Polymerase khi hoạt ựộng tổng hợp 1 mạch DNA mới từ mạch khuôn ựều cần có sự hiện diện của những mối chuyền riêng biệt. Mồi là những ựoạn DNA ngắn, có khả năng bắt căp bổ sung với một ựầu của mạch khuôn và DNA Polymerase sẽ nối dài mồi ựể hình thành mạch mới. Phương pháp PCR ựã ựược hình thành dựa vào ựặc tắnh ựó của các DNA Polymerase. Vì vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyền riêng biệt bắt cặp bổ sung với hai ựầu của một trình tự DNA, sẽ chỉ tổng hợp ựựoc ựoạn DNA nằm giữa hai mối ựó. điều ựó có nghĩa là ựể khuếch ựại một

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39 trình tự DNA xác ựịnh, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự ựó ựủ ựể tạo ra các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm có mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer). Từ xuôi và ngược ựược hiểu là xuôi và ngược với chiều phiên mã của gen.

* Cách tiến hành:

- DNA mẫu: Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli mọc trên môi trường thạch máu ở 37ồC / 24h.

- Hỗn hợp phản ứng PCR gồm:

Primers: 1ộl mỗi loại

Dung dịch ựêm (5X): 5.0 ộl. Enzyme (Taq Polyméae): 0.05 ộl.

Nước khử ion vừa ựủ ựể ựạt chuẩn thể tắch cuối cùng là 25 ộl cho 1 phản ứng.

- Chu trình của phản ứng PCR: Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước và ựược thực hiện trong máy nhân gen tự ựộng Perkin Elmer, theo sơ ựồ sau :

Chu trình

thứ nhất ^{30 chu trình tiếp theo}

Chu trình cuối Yếu tố gây bệnh Biến tắnh (ồC/phút) Biến tắnh (ồC/phút) Gắn mồi (ồC/phút) Tổng hợp (ồC/phút) Tổng hợp (ồC/phút) Sta, Stb, LT 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F4, F5, F6 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7 F41, F18 94/5 94/1 55/1 72/1 72/7

- Chạy ựiện di : sản phẩm PCR thu ựược sau khi chu trình phản ứng ựược nhuộm bằng chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye) ) với mẫu theo tỷ lệ 1: 5. Sau khi nhuộm, sản phẩm PCR ựược chạy ựiện di trên thạch agarose 2%

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40 trong dung dịch ựệm TAE (Tris - Acetic - EDTA) với hiệu ựiện thế 100V trong vòng 40 phút. đây là cách ựể cho các ựoạn acid hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên nguyên lý là các phân tử acid nucleic trong môi trường pH trung tắnh thì tắch ựiện âm nhờ các nhóm photphat nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleic. Khi ựặt chúng vào ựiện trường, các phân tử acid nucleic sẽ chuyển dịch về cực dương. Khi tiến hành phân tắch trên thạch agarose, các phân tử acid nucleic tùy theo kắch thước sẽ chuyển dịch với tốc ựộ khác nhau: Loại phân tử có kắch thước lớn chạy chậm, loại có kắch thước bé chuyển dịch nhanh hơn.

- Nhuộm: Gel thạch sau khi chạy ựiện di ựược nhuộm màu bằng chất nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (Bet 1 ộl/ml) trong vòng 15phút. Bet là một loại chất nhuộm huỳnh quang, phân tử của nó chui vào liên kết giữa các bazơ. Vị trắ cố ựịnh của các nhóm có khoảng cách gần với bazơ, tạo ra một lượng huỳnh quang lớn hơn rất nhiều so với các phân tử Bet tự do.

- đọc kết quả : Bằng cách quan sát dưới ánh ựèn UV (300mm) và chụp ảnh bằng hệ thống GelDoc. Trên ảnh chụp nền ựen, các ựoạn axit nucleic hiện lên ở dạng băng màu trắng vào thể chụp ảnh ựược và ghi nhận lại. Kắch thước các băng DNA ựược so sánh với DNA chuẩn (DNA maker), ựược cho vào cùng lúc với sản phẩm PCR ở một giếng riêng biệt, cạnh các giếng dùng phát hiện các sản phẩm PCR. Nhờ chỉ thị dây chuyền này mà người ta có thể xác ựịnh ựược ựộ dài của ựoạn thẳng PCR.

3.4.6. Xác ựịnh Serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập ựược bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh. phân lập ựược bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh.

Vi khuẩn E.coli có nhiều serotyp O khác nhau, do vậy bước quan trọng ựầu tiên là xác ựịnh ựược nhóm serotyp O, sau ựó tiến hành các phản ứng kết ngang kết với huyết thanh ựơn giá trong nhóm cần xác ựịnh. Những nguyên liệu cơ bản cho việc xác ựịnh serotype gồm:

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41 + Các chủng E. coli cần ựịnh typ ựược nuôi trên môi trường thạch máu. + Các kháng nguyên huyết thanh O chuẩn (ựa giá và ựơn giá).

* Phương pháp tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kắnh như sau:

Nhỏ lên 2 ựầu lam kắnh sạch, mỗi ựầu 1 giọt nước muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc E.coli cần xác ựịnh trên môi trường thạch máu trộn ựều với 2 giọt nước muối sinh lý thành huyễn dịch vi khuẩn. Nhỏ một giọt kháng huyết thanh chuẩn vào một bên huyến dịch và một giọt nước muối sinh lý vào bên huyễn dịch còn lại (ựối chứng).

+ Phản ứng dương tắnh khi hình thành ngưng kết giữa kháng nguyên là vi khuẩn với huyết thanh, tạo thành những hạt nhỏ trắng lấm tấm, huyễn dịch tách ra làm 2 phần là các hạt ngưng kết và phần nước lỏng. Với phản ứng ngưng kết xảy ra nhanh, rõ rệt thì ựược ựánh giá mức ++++. Tùy theo khả năng ngưng kết nối ựể có thể ựánh giá mức ngưng kết ở các mức ựộ khác nhau +,++,+++.

+ Phản ứng là âm tắnh khi hỗn dịch vi khuẩn với kháng nguyên thanh ựục ựều như bên ựối chứng.

* Với những chủng có ngưng kết với kháng huyết thanh nhóm, tiếp tục thực hiện như vậy với các kháng huyết thanh ựơn giá thuộc nhóm ựể xác ựịnh rõ từng serotype. Trong trường hợp các chủng có hiện tượng ngưng kết chéo với nhiều nhóm hoặc ngưng kết với nhiều ựơn giá khác nhau, thì phải pha loãng kháng huyết thanh theo cấp số 2, kết quả sẽ lấy ngưng kết ở cấp số pha loãng cao nhất.

3.4.7. Kiểm tra ựộc lực của chủng vi khuẩn E.coli phân lập trên chuột bạch

để xác ựịnh ựộc lực của vi khuẩn E.coli gây bệnh, có thể thực hiện ựược bằng phương pháp tiêm truyền qua ựộng vật thắ nghiệm. Các bước thực hiện như sau: Canh trùng BKI/37ồC/24h ựối với vi khuẩn E.coli ựược

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42 tiêm vào phúc xoang cho các chuột bạch khỏe mạnh. Mỗi chủng dùng 2 chuột. Theo dõi thời gian chuột chết, số chuột chết trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô ựể ựánh giá ựộc lực của vi khuẩn. Mổ khám, phân lập vi khuẩn từ máu tim của các chuột chết.

3.4.8. Xác ựịnh khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các vi khuẩn phân lập ựược lập ựược

Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các vi khuẩn E.coli phân lập, ựược kiểm tra bằng phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuyếch tán trên ựĩa thạch và ựánh gắa kết quả theo tiêu chuẩn của Hội ựồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thắ nghiệm (NCCLS) (1999).

* Phương pháp tiến hành như sau:

- Bước 1: chuẩn bị môi trường thạch ựĩa Muller Hinton.

- Bước 2: các chủng vi khuẩn ựược nuôi cấy trong môi trường thạch máu ở 37ồC. Lấy 1 khuẩn lạc, hòa vào 1,5 ml nước sinh lý ựể ựạt ựược ựộ ựục 0,5 trong dãy so sánh màu McFarland. Dùng tăm bông vô trùng, tẩm dung dịch ựã pha loãng và dàn ựều lên thạch ựĩa Muller Hinton.

- Bước 3: dùng máy tự ựộng ựặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid lên mặt ựĩa thạch.

- Bước 4: bồi dưỡng ựĩa thạch ở 37ồC/18h - 24 h. đọc kết quả bằng cách ựo ựường kắnh vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn ựể ựánh giá mức ựộ mẫn cảm hay kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.

đọc kết quả: sau 24 giờ, lấy ựĩa thạch ra, dùng thước ựo ựường kắnh của vòng vô khuẩn (ựược ựo từ phắa sau mặt ựĩa). Nếu cạnh của vòng vô khuẩn không rõ nét, phải tắnh ở khu vực ức chế xấp xỉ 80% vi khuẩn không mọc. đường kắnh vòng vô khuẩn ựược tắnh bằng mm. Dựa vào bảng quy ựịnh ựánh giá mức ựộ mẫn cảm của E.coli với thuốc kháng sinh.

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 43 Bactrim (Bt) còn gọi là Trimazon, là sự phối hợp giữa 2 loại Sulfamid: Trimethoprim và Sulfamethoxazol theo tỷ lệ 1/5. (Phan Sỹ Lăng, Lê Thị Tài 1999).

Cách ựánh giá mức ựộ mẫn cảm của vi khuẩn với kháng sinh thử theo bảng sau

đường kắnh vòng vô khuẩn (mm) ựể xác ựịnh mức ựộ mẫn cảm với kháng sinh của

vi khuẩn E. coli Kháng sinh ^Hàm lượng Mẫn cảm Kháng Ampicillin (Am) 10 ộg 16 Ờ 22 < 16 Bactrim (Bt) 25 ộg 23 Ờ 29 < 23 Colistin (Co) 10 ộg 11 Ờ 15 < 11 Kanamycin (Kn) 30 ộg 17 Ờ 25 < 17 Nalidixic acid (Ng) 30 ộg 22 Ờ 28 < 22 Neomycine (Ne) 30 ộg 17 Ờ 23 < 17 Tetracycline (Te) 30 ộg 18 Ờ 25 < 18

3.4.9.Thử nghiệm một số phác ựồ ựiều trị hội chứng tiêu chảy trên ựàn lợn rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang

Từ kết quả xác ựịnh mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập ựược, chúng tôi ựã tiến hành lựa chọn một số phác ựồ ựể ựiều trị thử nghiệm cho các lợn bị tiêu chảy. để ựánh giá ựược hiệu quả một cách khách quan, các phác ựồ ựược thực hiện có sự ựồng ựều về các tiêu chắ cơ bản sau:

+ Số lợn bị tiêu chảy ựược phân ra làm 2 lô tương ứng với 2 phác ựồ ựiều trị bệnh.

+ Số lần và ngày ựiều trị bệnh ựược dùng ựồng ựều trong các phác ựồ. + đánh giá hiệu quả của các phác ựồ ựiều trị căn cứ vào sự ổn ựịnh dần của trạng thái phân, tình trạng ăn uốngẦsau 5 ngày, kể từ khi dùng thuốc.

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 44

3.4.10. Phương pháp xử lý số liệu

Sử dụng phương pháp thống kê sinh vật học, tắnh toán bằng chương trình Excel. Số trung bình: n X X n 1 i i

∑

( )

( )

Trong ựó: X_i: giá trị các mẫu quan sát X: số trung bình n: dung lượng mẫu

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 45

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1. Cơ cấu ựàn lợn rừng ựang ựược nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang qua các năm (từ 2010 ựến tháng 6/2012) Bắc Ninh và Bắc Giang qua các năm (từ 2010 ựến tháng 6/2012)

Nhằm nắm bắt thực trạng chăn nuôi lợn rừng liên quan ựến hội chứng tiêu chảy trên ựàn lợn rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang. Chúng tôi xây dựng các tiêu chắ ựiều tra, phỏng vấn kết hợp với nguồn tư liệu thống kê của Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn các tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang. Kết quả thu ựược chúng tôi trình bày ở các phần dưới ựây:

Bảng 4.1. Cơ cấu ựàn lợn rừng ựang ựược nuôi tại một số trang trại

thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang qua các năm (2010 ựến tháng 6 năm 2012) Năm Loại lợn (con) 2010 (con) 2011 (con) 6 tháng ựầu năm 2012 (con) Lợn ựực 240 280 280 Lợn nái 306 378 215 Lợn hậu bị 384 316 316 Lợn choai 218 266 146

Lợn sau cai sữa 292 324 218

Lợn con theo mẹ 2.086 2.230 1.036

Tổng 3.520 3.794 2.211

Kết quả bảng 4.1 cho thấy: năm 2010 tổng số ựàn lợn rừng theo các ựộ tuổi ựang ựược nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang là 3.520 con. Nhưng ựến năm 2011 tổng số ựàn lợn rừng ựã tăng lên tới 3.794

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 46 con và chỉ 6 tháng ựầu năm 2012 tổng số ựàn lợn rừng ựã có tới 2.211 con. Thực tế ựiều tra cho thấy nguyên nhân chắnh ựể tổng ựàn lợn rừng tăng nhanh hàng năm do lợn rừng vốn là loài hoang dã, khỏe mạnh, có sức ựề kháng cao, rủi ro trong chăn nuôi hạn chế.

4.2. Kết quả ựiều tra tình hình mắc hội chứng tiêu chảy trên ựàn lợn rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang rừng nuôi tại một số trang trại thuộc tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang

Hội chứng tiêu chảy ở lợn rừng là một hiện tượng xảy ra thường xuyên