Cúm (Influenza) là bệnh truyền nhiễm cấp tính thường xảy ra vào mùa đông, ở
vùng khí hậu ôn đới; tuy nhiên, bệnh cũng có thể xuất hiện hai lần trong một năm ở
vùng nhiệt đới. Bệnh cúm do virus thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên. Họ
Orthomyxoviridae được chia thành 4 nhóm: virus cúm A (Influenza A virus), virus cúm B (Influenza B virus), virus cúm C (Influenza C virus) và Thogotovirus. Các nhóm này được phân biệt bởi nucleoprotein NP và M. Ba nhóm đầu gây nên các kiểu
bệnh cúm tương ứng là: cúm A, cúm B và cúm C. Cúm B chỉ gây nhiễm trên người,
tạo ra những dịch nhẹ và rải rác. Virus cúm C gây bệnh trên người và cũng được tìm thấy ở một số lợn tại Trung Quốc; không thấy biểu hiện nguy hiểm cho người. Trái
lại, virus cúm A, với nhiều phân tuýp khác nhau, gây nhiễm trên người, gia cầm và rất
nhiều loài động vật có vú, tạo nên những đại dịch kinh hoàng trong lịch sử.
Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các
vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm 2003 cho đến nay và phát sinh nhiều dưới dòng (sublineage) và nhóm/phân nhóm
(clade) có độc lực rất cao. Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gà tại Scotland vào năm 1959. Có thể gọi cúm A/H5N1 phân
lập năm 1959 tại Scotland là virus cúm A/H5N1 cổ điển (danh pháp: A-Ck- Scotland-(59)(H5N1) (số đăng ký: X07869). Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003 đến nay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gây bệnh),
Tế bào lympho B
Chuỗi H cADN
Chuỗi H mARN Chuỗi L mARN
Sao chép ngược 420C, 15 phút PCR, 30 chu kỳ 940C, 1 phút 550C, 2 phút 720C, 2 phút ADN nối PCR, 7 chu kì 940C, 1 phút 680C, 4 phút Mảnh ADN mã hóa scFv Chuỗi L cADN
loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyền lây có
nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 trước đây. Nhằm ngăn chặn dịch bệnh lây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế giới đã có hàng
trăm triệu gia cầm đã bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và
kinh tế. Đặc biệt, số người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1, mỗi năm một cao hơn, theo thống kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức
Y tế thế giới (WHO), từ năm 2003 đến tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp
mắc cúm A/H5N1, trong đó, 243 trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11%. Việt
Nam và Indonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do
virus cúm A/H5N1 trên thế giới. Tính gây bệnh của A/H5N1 thể độc lực cao
không chỉ giới hạn ở chức năng điểm cắt protease của HA và hoạt tính của NA, mà là hiệu ứng của sản phẩm đa gen và khả năng tái tổ hợp tạo virus mới với đặc tính
gây bệnh và độc lực khác nhau là vấn đề cần tính đến. Hàng ngàn công trình nghiên cứu về cúm A nói chung và cúm A/H5N1 nói riêng, đặc biệt trong 5 năm
gần đây, trong đó có phát triển công nghệ và (các loại) vaccine gây miễn dịch cho
gia cầm và chuẩn bị cho đại dịch có thể xảy ra ở người.
Trước tình hình lây lan của dịch cúm A/H5N1. Trên thế giới cũng như ở
Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu như:
Nghiên cứu định type, biến đổi di truyền và gen học tiến hóa của virus cúm
A/H5N1 được các cơ quan nghiên cứu của Việt Nam tiến hành ngay từ những tháng đầu tiên xảy ra dịch cúm gia cầm cuối năm 2003. Những chuỗi gen giúp xác định
phân type H5, phân type N1 và các gen cấu trúc đã được Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Viện Thú y giải mã và công bố trên Ngân hàng gen. Các biến chủng H5N1 của Hồng Kông, Trung Quốc
phân lập những năm 1997 - 2001 và Hàn Quốc, Đài Loan (phân lập năm 2003) đều có
nguồn gốc từ chim cút và ngỗng (A/Goose/Guandong/1/96) vùng Quảng Đông
(Trung Quốc), đó là các biến chủng thuộc dòng Quảng Đông [28]. Như vậy, virus
cúm gia cầm gây bệnh ở gia cầm và người tại Việt Nam là cúm H5N1 type A thuộc
thế hệ mới đã có biến đổi cơ bản về gen H5 và gen N1, nhưng vẫn có cùng nguồn gốc
với H5N1 từ vùng địa lý Nam Trung Quốc và Hồng Kông [53]. Các chủng phân lập
những năm 2004-2006 đã được nghiên cứu khá chi tiết về góc độ gen học và quan hệ
phân tử với các chủng trong vùng và thế giới, kết quả khẳng định virus H5N1 vùng
Nam và Đông Nam Á thuộc nhóm di truyền VTM (viết tắt: Vietnam-Thailand- Malaysia), có những đặc tính sinh học nhất định khác với các nhóm vùng Trung Quốc
và Hồng Kông. Năm 2007, xuất hiện thêm biến chủng H5N1 dưới dòng Phúc Kiến tại
Việt Nam, đã và đang làm phức tạp thêm vấn đề dịch tễ học và quan hệ kháng nguyên và miễn dịch, do tỷ lệ tương đồng kháng nguyên HA(H5) và NA(N1) thấp so với các
Với khả năng lây nhiễm nhanh và tính chất nguy hiểm của virus cúm A/H5N1,
việc phòng chống cũng như dập tắt dịch đóng vai trò rất quan trọng. Để phát hiện cũng như dập dịch ngay tại hiện trường, thì vai trò của các phương pháp chẩn đoán, phát hiện bệnh trở nên vô cùng quan trọng, trong đó các loại kit chẩn đoán nhanh với ưu điểm dễ sử dụng, thời gian kiểm tra nhanh, tính di động cao là rất cần thiết.
Trên cơ sở khoa học và thực tiễn của đề tài tại Việt Nam hiện nay, xu hướng
nghiên cứu và phát triển các thành tựu từ công nghệ nano đang trở nên hấp dẫn và có những ứng dụng khả quantrong lĩnh vực y sinh học. Quy trình chế tạo hạt nano vàng thuận tiện với các đặc tính quang học đặc trưng phù hợp trong đánh dấu sinh học, làm tiền đề cho việc chế tạo các kit chẩn đoán nhanh các bệnh cấp tính lây lan nhanh được coi là hướng nghiên cứu chính của các nhà khoa học. Việc chủ động tạo nguồn kháng
thể được phân lập tại các phòng thí nghiệm trọng điểm, từ đó làm cơ sởcho việc chế
tạo nên các kit chẩn đoán nhanh với chi phí rẻ, dễ sử dụng và có thể được sử dụng rộng
rãi tại tất cả các vùng miền trên cả nước. Do đó, việc thực hiện đề tài cũng là bước đầu đặt cơ sở cho việc nghiên cứu, chế tạo và hoàn thiện kit chẩn đoán nhanhsử dụng hạt
nano vàng gắn kháng thể cúm, đặc biệt là công nghệ chế tạo que thử nhanh sử dụng
phức hợp kháng thể/nano vàng nhằm phát hiện nhanh virus cúm A/H5N1 có ý nghĩa
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP