3.1.5.1. Thời gian phản ứng
Phổ hấp thụ UV của 11 mẫu (No1-No11) với các khoảng thời gian phản ứng
khác nhau. 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) A d so rp ti o n
Hình 3.5. Phổ hấp thụ UV của các mẫu vàng trong các khoảng thời gian phản ứng
khác nhau.
Từ hình 3.5, có thể quan sát thấy sự dịch chuyển của đỉnh phổ hấp thụ theo
chiều hướng đi về phía bước sóng ngắn hơn thay đổi dần theo hướng tăng dần khi
thời gian phản ứng thay đổi từ 2-40 phút. Khi thời gian phản ứng từ khoảng 20 phút
đến 40 phút thì màu đỏ của dung dịch hầu như không thay đổi. Khảo sát bằng phương pháp đo phổ hấp thụ UV cho phép chúng ta quyết định tính chính xác hơn rất nhiều
No 1 No 2 No 5 No 4 No 3 No 11
so với trực quan. Phổ hấp thụ UV của các mẫu dung dịch nano vàng sau các từ 2 phút đến 40 phút. Phổhấp thụ của mẫu dung dịch sau 2phút phản ứng có độ hấp thụ cũng
như độ lớn đỉnh hấp thụ thấp nhất và khi phản ứng diễn ra sau 20 phút, phổ UV bắt đầu đạt cực đại và không thay đổi khi thời gian phản ứng tăng lên 40 phút. Mối liên quan giữa sự phụ thuộc của kích thước và mật độ hạt nano vàng vào thời gian phản ứng: thời gian phản ứng đóng vai trò quyết định, và phản ứng đạt điều kiện tối ưu với
thời gian 20 phút, sau đó, phản ứng hầu như không thay đổi, chứng tỏ phản ứng kết
thúc sau khoảng 20 phút. Mật độ của hạt nano vàng tăng lên theo thời gian phản ứng
kéo dài. Kết quả này có thể được giải thích như sau: khi dung dịch chất khử được nhỏ
vào dung dịch muối vàng, phản ứng bắt đầu xảy ra với việc hình thành nên các mầm
tinh thể vàng ở mật độ rất thấp, sau đó phản ứng xảy ra với chiều hướng tăng rất
nhanh sau khoảng 10 phút, phản ứng tiếp tục xảy ra cho đến khi tất cả các ion Au3+ được khử hết thành Au0 và tất cả các ion citrate bám xung quanh hạt vàng. Hạt vàng
khi đó đạt trạng thái ổn định và cân bằng bền về mặt điện tích trong dung dịch.
3.1.5.2. Thay đổi lượng chất khử natri citrate
Phương pháp Turkevich, như đã giới thiệu, sẽ tạo ra các hạt AuNPs đơn phân tán được làm bền bởi các ion âm citrate bọc xung quanh hạt nano. Kết quả nghiên cứu
của chúng tôi dẫn đến kết luận: nồng độ (hay hàm lượng chất khử ảnh hưởng mạnh đến kích thước của hạt AuNPs hình cầu). Trên hình 3.6 mô tả sự thay đổi của phổ hấp
thụ của các mẫu khi hàm lượng chất khử tăng lên. Cụ thể là có hai xu hướng thay đổi khi hàm lượng citrate tăng lên. Ban đầu, khi tăng lượng chất khử, đỉnh hấp thụ cực đại có sựdịch chuyển về phía bước sóng ngắn và cùng với sự tăng lên của cường độ
hấp thụ, sau đó khi lượng chất khử tăng lên quá nhiều, đỉnh hấp thụ lại xu hướng dịch
chuyển về phía về bước sóng dài, tuy nhiên cường độ cũng giảm theo.
Dođó, hiện tượng dịch chuyển đỉnh hấp thụ cùng với sự thay đổi cường độ hấp
thụ khi tăng giảm lượng citrate có thể được giải thích như sau: hạt nano vàng sẽ hình thành bởi vì các ion citrate sẽ bao xung quanh bề mặt lõi vàng, nó đóng cả hai vai trò làm tác nhân khử cũng như tác nhân làm bền hạt nano. Để tạo ra các hạt nano vàng lớn hơn, yêu cầu một lượng ít hơn citrate và sau đó một lượng nhỏ hơn sẽ không thể
kích thích phản ứng khử hết các ion Au3+. Việc khử các ion Au3+ trong dung dịch, lượng natri citrate sẽ giảm lượng ion citrate sẵn có cho việc bọc xunh quanh hạt nano vàng, điều này sẽ làm cho các hạt nhỏ kết đám với nhau và tạo nên những hạt lớn hơn (cho đến khi tổng diện tích bề mặt của các hạt trở nên đủ nhỏ để được bọc bởi tất cả
các ion citrate tồn tại trong dung dịch). Điều đó có nghĩa là khi lượng citrate càng lớn, nó đủ để bọc xung quanh các hạt vàng vừa mới sinh ra trong quá trình khử, và do đó,
các hạt AuNPs sẽ nhỏ hơn do có đủ lượng citrate bọc xunh quanh chúng. Tuy nhiên,
khi lượng citrate quá nhiều, một hiện tượng thuận nghịch có thể xảy ra, các ion Na+ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
và làm cho hạt bị mất cân bằng điện tích. Chính vì thế, dẫn đến sự kết đám của các
hạt và làm cho dung dịch mất màu đồng thời cường độ hấp thụ giảm.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) A d so rp ti o n
Hình 3.6. Phổ hấp thụ của các mẫu dung dịch AuNPs theo bảng với hàm lượng citrate
khác nhau.
Qua khảo sát chúng tôi nhận thấy mẫu N3 (lượng dung dịch natri citrate là 3.5 ml (1%), lượng muối vàng 100µl (5%), thời gian phản ứng 20 phút) đạt điều kiện tối ưu nhất. Với mẫu này, lượng citrate cho phản ứng với các lượng muối vàng, thời gian
phản ứng đã đặt ra trong thí nghiệm là phù hợp và có điều kiện tốt nhất từ việc phân
tích phổ hấp thụ UV.
3.1.5.3. Thời gian và điều kiện bảo quản hạt AuNPs
Điều kiện bảo quản đóng vai trò rất quan trọng đối với các mẫu AuNPs, bởi vì chúng rất nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ cao. Khi để mẫu dung dịch AuNPs ở điều kiện nhiệt độ phòng và bị chiếu sáng trực tiếp, dung dịch dễ dàng bị mất màu dần dần sau khoảng hai tuần. Hiện tượng này có thể được giải thích như sau: do bề
mặt hạt AuNPs có điện tích và năng lượng tự do rất lớn, khiến chúng rất dễ mất cân
bằng nhiệt động, có xu hướng kết lại với nhau thành những đám hạt lớn hơn để giảm
bề mặt riêng chuyển sang trạng thái bền hơn. Các hạt AuNPs cũng rất nhạy quang, do khi để dưới ánh sáng trực tiếp trong thời gian dài, các phản ứng quang hóa sẽ làm cho
kích thước hạt thay đổi.
Các hạt AuNPs có độ ổn định cao theo thời gian và điều kiện bảo quản tốt nhất
là ở 40C và tránh ánh sáng hoàn toàn. Các mẫu dung dịch đều được bọc bằng giấy bạc và để trong tủ lạnh 40C. Độ bền của dung dịch được kiểm chứng bởi việc đo phổ hấp
thụ UV (hình 3.7) sau thời gian 30 ngày bảo quản để đánh giá độ lệch phổ cũng như
dịch chuyển của cực đại hấp thụ.
N1 N2 N3 N4 N5 N6
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) A d so rp ti o n
Hình 3.7. Phổ hấp thụ của mẫu AuNPs ban đầu và sau thời gian 30 ngày Phổ hấp thụ hầu như không có sự thay đổi sau thời gian 30 ngày và đỉnh hấp
thụ không bị dịch chuyển. Chỉ có rất ít sự sai khac giữa hai phổ hấp thụ mà không có sự dịch chuyển của vị trí đỉnh hấp thụ cực đại. Chứng tỏ dung dịch AuNPs rất bền trong điều kiện bảo quản phù hợp là 40C tránh ánh sáng và có thể sử dụng lâu dài.
3. 2. Tạo phức hợp AuNPs gắn kháng thể cúm A
3. 2.1. pH tối ưu cho phản ứng gắn kháng thể/nano vàng
Hình 3.8. Sự thay đổi màu dung dịch với lượng kháng thể gắn như nhau ở các pH
khác nhau từ trái sang lần lượt từ pH 5 - pH 11.
Để tìm pH thích hợp nhất cho việc phản ứng gắn giữa các phân tử khángthể và bề mặt chứa nhóm chức –COOH trên hạt nano vàng. Chúng tôi tiến hành phản ứng
gắn với 7 mẫu dung dịch lần lượtcó pH từ 5 đến 11. Sau khi dùng NaCl để kích thích
sự kết tủa của dung dịch nano, chúng tôi quan sát sự thay đổi màu của các dung dịch. Đối với các mẫu với các pH cao, sau khi kích thích sự kết tủa của các hạt nano bằng
NaCl, dung dịch trở nên mất màu (hình 3.8) và chuyển sang màu xám, chứng tỏ các (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
hạt nano vàng đã bị co cụm và lắng xuống đáy, màu của dung dịch thay đổi là do đặc trưng hấp thụ Plasmon đã bị thay đổi bởi kích thước. Đối với mẫu nano vàng có pH =5, chúng tôi nhận thấy màu của dung dịch không bị thay đổi, chứng tỏ các hạt nano vàng đã được bọc bởi các phân tử kháng thể xung quanh, với lượng đủ để ngăn cản
việc co cụm giữa các hạt nano vàng sau khi bị kích thích bởi NaCl.
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10 pH 11
ban đầu
Vậy có thể kết luận, tại pH 5 là pH tối ưu nhất cho phản ứng gắn giữa hạt nano
vàng và kháng thể kháng virus cúm A/H5N1. pH tối ưu cho việc gắn kháng thể với
các hạt nano vàng được định nghĩa với pH mà tại đó cho phép kháng thể gắn hiệu quả
nhất lên bề mặt hạt nanovàng.Lý do đưa ra các pH khác nhau cho việc gắn kháng thể
lên bề mặt hạt nano vàng là do với mỗi loại kháng thể, chúng đều có điểm đẳng điện đặc trưng. Điều kiện để các kháng thể gắn hiệu quả nhất lên bề mặt hạt nano vàng là khi pH của dung dịch gần với điểm đẳng điện pI của kháng thể.
3. 2.2. Tìm lượng kháng thể thích hợp cho phản ứng gắn
Khi ở pH thích hợp, các protein có thể được hòa tan dễ dàng trong dung dịch
chứa các AuNPs với hoạt tính hóa học bề mặt rất lớn. Nhóm –COOH xung quanh bề
mặt của AuNPsdễ dàng kết hợp với nhóm –NH2 trên chuỗi peptide của protein. Phản ứng được mô tả bởi phương trình sau:
Lượng protein gắn lên bề mặt AuNPs khác nhau đối với từng loại protein và với các kích thước hạt khác nhau. Hạt càng nhỏ, lượng protein gắn lên bề mặt càng lớn, tuy nhiên nếu có quá nhiều protein gắn lên hạt, đó sẽ là một bất lợi cho phức hợp
kháng thể/nano vàng bởi vì một số protein liên kết yếu có thể tách khỏi bề mặt hạt nano. Điều này sẽ làm các hạt có gắn protein trở nên kém hiệu quả vì các protein tự
do sẽ cạnh tranh với các miền gắn trên hạt nano.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) A d so rp ti o n
Hình 3.9. Phổ hấp thụ của dung dịch nano vàng trước (đườnga ) và sau khi gắn kháng
thể (đường b)
a
Quan sát phổ hấp thụ có thể nhận ra với lượng kháng thể tăng lên càng cao, đỉnh
của phổ hấp thụ càng gần với đỉnh của phổ hấp thụ ban đầu của dung dịch AuNPs chưa
gắn. Khi so sánh phổ hấp thụ của hai mẫu nano vàng trước và sau khi gắn kháng thể lên bề mặt (hình 3.9) cho thấy cực đại của phổ hấpthụ của dung dịch sau khi gắn kháng thể
bị dịch đi ở vị trí 527 nm. So với đỉnh hấp thụ ban đầu, cực đại đã bị dịch đi 3 nm,
chứng tỏ kích thước hạt đã bị tăng lên so với khi chưa bọc, hoặc sự tác động của lớp
bọc khiến đỉnh cực đại hấp thụ thay đổi.
Để đánh giá việc bọc thành công của kháng thể cúm A/H5N1lên hạt nano vàng, chúng tôi cũng tiến hành song song việc phân tích phổ hấp thụ FTIR với của mẫu để so
sánh với phổ ban đầu (hình 3.10)
Hình 3.10. Phổ hấp thụ FTIR của mẫu nano vàng không gắn kháng thể (A) và mẫu
sau khi gắn kháng thể lên bề mặt (B). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
A. Mẫu vàng ban đầu
Chúng ta có thể thấy đỉnh đặc trưng cho dao động của nhóm –OH ở khu vực ~
3400 bị giảm hẳn so với mẫu nano vàng chưa gắn kháng thể. Dao động tương ứng vị
trí 1690 cm-1của phổ FTIR với mẫu vàng khi chưa gắn kháng thể đã biến mất ở vị trí tương ứng đối với mẫu đã gắn kháng thể lên bề mặt hạt vàng. Điều này chứng tỏ hầu
hết các nhóm carboxyl (–COOH) có thể đã tham gia vào liên kết với nhóm –NH2 của
phân tử kháng thể. Do đó đỉnh hấp thụ này không xuất hiện tại phổ của mẫu vàng đã gắn. Ngoài ra chúng ta có thể thấy sự xuất hiện của dao động rất mạnh tương ứng với
vị trí 1111.27 cm-1 trên phổ của mẫu kháng thể/nano vàng và sự xuất hiện của các đỉnh với biên độ cao hơn ở các vị trí 1278.98 cm-1, 1235 cm-1, các vạch này là đặc trưng cho liên kết C–N và C–C trong phân tử kháng thể. Kết quả trên phù hợp với kết
quả phân tích phổ hấp thụ UV và ảnh hiển vi điện tử quét SEM (hình 3.11).
Hình 3.11. Các hạt AuNPs trước (A) và sau khi gắn kháng thể (B)
Kết quả chụp phân tích SEM (hình 3.11) cho thấy các hạt nano vàng có xu
hướng đứng xếp gần nhau, tuy nhiên không gây ra hiện tượng co cụm thành hạt lớn hơn, biên hạt vẫn được phân biệt rõ ràng. Kết hợp với kết quả phân tích phổ hấp thụ
UV, có thể kết luận rằng hạt nano vàng đã được bọc thành công bởi các phân tử
A
kháng thể và tạo thành lớp vỏ mỏng xung quanh bề mặt hạt. Tuy nhiên do hạn chế
của độ phân giải của thiết bị SEM, chúng ta không thể quan sát thấy rõ lớp vỏ bọc
kháng thể trên bề mặt hạt, các hạt có xu hướng co cụm lại gần nhau để cực tiểu hóa năng lượng bề mặt, do khi đó cácphân đoạn protein đã được gắn trên bề mặt và thay
đổi năng lượng riêng bềmặt của chúng.
Để tìm ra lượng kháng thể thích hợp nhất cho việc gắn kháng thể lên bề mặt
hạt nano vàng, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm với 15 lượng kháng thể khác nhau từ 1-100 µl (nồng độ 100 µg/ml) cho các mẫu cùng lượng 1 ml dung dịch chứa
các nano vàng sau khi chế tạo. Bằng việc phân tích phổ hấp thụ UV để nhận biết sự thay đổi của đỉnh hấp thụ khi cho kháng thể liên kết với hạt nano trong dung dịch. Màu của dung dịch nano vàng sau khi gắn thay đổi từ dung dịch bị kết tủa tím than đến không thay đổi màu so với dung dịch nano ban đầu sau khi thêm dung dịch NaCl để
kích thích sự kết tủa của các hạt nano vàng (hình 3.12A).Đối với các mẫu có đủ lượng
kháng thể gắnlên bề mặt hạt nano vàng, màu của dung dịch sẽ không thay đổi, tức là các hạt nano không bị co cụm. Việc tiến hành đo phổ hấp thụ UV sẽ cung cấp thông tin chính xác hơn cho việc quyết định lượng kháng thể nào là phù hợp nhất. Đỉnh của
phổ hấp thụ dịch chuyển từ phía bước sóng dài về phía bước sóng ngắn hơn khi tăng
dần lượng kháng thể. Đến khi lượng kháng thể phù hợp thích hợp nhất đỉnh của phổ
hấp thụ sẽ ngừng thay đổi và giữ cố định kể từ đó. Sau đó, tăng lượng kháng thể lên,
nhưng đỉnh hấp thụ vẫn giữ nguyên vị trí và không thay đổi đáng kể.
Theo đó, ứng với mẫu sử dụng 50 µl (nồng độ 100µg/ml) dung dịch pha loãng là
lượng phù hợp nhất cho phản ứng gắn kháng thể lên hạt nano vàngChúng tôi tính được lượng kháng thể thích hợp nhất cho việc gắn kháng thể với AuNPs là 5µg/ml dung dịch
AuNPs (hình 3.12B). Giả sử lượng ion Au3+đã tham gia phản ứng hết và tạo thành Au0 theo quy trình chế tạo ở trên, chúng tôi tính được trong 1ml dung dịch nano đã chế tạo (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chứa khoảng 36 µg hạt nano vàng. Từ đó có thể kết luận rằng tỉ số lượng kháng
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength(nm) A b so rb a n ce
Hình 3.12. (A) Từ trái sang với các mẫu gắn lượng protein thay đổi từ (1 -100 µl kháng thể nồng độ 100µg/ml trên 1ml dung dịch AuNPs). (B) Phổ hấp thụ của các
mẫu sau khi bổ sung dung dịch NaCl để kích thích kết tủa của dung dịch.
3.3. Kiểm tra phát hiện virus cúm A/H5N1 bằng phức hợp kháng thể/nano vàng