3. 2.2 Tìm lượng kháng thể thích hợp cho phản ứng gắn
3.3. Kiểm tra phát hiện virus cúm A/H5N1 bằng phức hợp kháng thể/nano vàng
vàng
3.3.1. Kết quả phát hiện kháng nguyên virus cúm A bằng Dot blot.
Hình 3.13. Kết quả kiểm tra bằng Dot Blot với các nồng độ kháng nguyên khác nhau cố định trên màng 5 mm 50 µg/ml 25 µg/ml 12 µg/ml 6 µg/ml 3 µg/ml 1 µg/ml 25 µg/ml B A
Kết quả kiểm tra bằng Dot blot cho thấy vùng chấm tròn thể hiện sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên của virus cúm A và kháng thể gắn trên bề mặt hạt nano
vàng. Các hạt nano vàng đóng vai trò như một sensor màu giúp cho phép kiểm tra có
thể quan sát bằng mắt thường. Các hạt nano vàng gắn kháng thể bị bắt lại bởi kháng
nguyên và giữ cố định trên màng tạo ra một vùng chấm tròn màu đỏ, các vùng khác không chứa kháng nguyên cố định do đó chúng không tạo ra màu đỏ do không có sự
xuất hiện của các hạt nano vàng. Với các nồng độ khác nhau thay đổi từ 50 µg/ml đến 1 µg/ml, kết quả cho thấy độ đậm của vùng bị kháng nguyên tóm bắt thay đổi
tuyến tính khi nồng độ giảm.Kết quả này đóng vai trò rất quan trọng trong việc quyết định một cách định tính lượng kháng nguyên gắn trên màng. Với nồng độ càng lớn,
màu của chấm càng đậm do có nhiều hạt nano vàng bị bắt lại, ngược lại, màu của
chấm sẽ nhạt hơn khi nồng độ đó giảm xuống.
3.3.2. Kết quả kiểm tra thử nghiệm bằng que thử đơn giản
Hình 3.14. Vạch kháng thể kháng virus cúm A được cố định trên màng nitrocellulose bắt các hạt kháng thể/nano vàng và tập hợp thành vạch. Vạch có thể
quan sát dễ dàng bằng mắt thường sau thời gian kiểm tra từ 5-10 phút.
Sau khi chuẩn bị phức hợp kháng thể/nano vàng và mô hình que thử đơn giản
với màng nitrocellulose gắn kháng nguyên lên bề mặt thành dạng vạch, que thử được
nhúng vào dung dịchchứa phức hợp kháng thể/nano vàng để kiểm tra. Vạch màu đỏ
chứa các hạt nano vàng có gắn kháng thể xuất hiện rất rõ sau thời gian 10 phút (hình 3.13). Kết quả này chứng tỏ hạt nano vàng gắn kháng thể đã bị tóm bắt đặc hiệu bởi
kháng nguyên được cố định trên bề mặt màng. Kết quả các trên có thể được mô tả như sau: khi bắt đầu nhúng que thử vào dung dịch, lực mao dẫn của dòng chất lỏng
giúp đẩy các hạt nano vàng có gắn kháng thể chạy dọc theo các ống nhỏ li ti của màng và đi lên trên. Đến khi gặp các kháng nguyên cúm A gắn tại vị trí cố định trên màng, chúng tóm bắt và giữ lại do phản ứng đặc hiệu, cứ như thế, các hạt nano vàng tụ tập thành đám với số lượng ngày càng lớnkhi dòng mao dẫn vượt qua màng. Khi ở kích thước nano mét, hiệu ứng Plasmon trên bề mặt hạt vàng giúp chúng có được màu sắc đặc trưng tùy thuộc kích thước và hình dạng của hạt. Với số lượng lớn các hạt bị
giữ lại, chúng đã tạo nên một hiệu ứng màu đủ lớn để có thể quan sát bằng mắt thường. Đây chính là nguyên tắc cơ bản cho việc phát hiện ra sự có mặt của virus
cúm A/H5N1 cố định trên que thử. Với thời gian kiểm tra rất ngắn và đem lại kết quả
khá chính xác, mô hình que thử này được đánh giá là đem lại hiệu quả kiểm tra rất
cao.
Que thử đơn giản được thiết kế còn khá thô sơ với mục đích chính là để kiểm
tra khả năng phát hiện virus cúm A bằng phức hợp kháng thể/nano vàng. Để xây
dựng được quy trình chế tạo que thử nhanh với các thông số kỹ thuật phù hợp như độ
nhạy của phép kiểm tra, độ bền của que, điều kiện bảo quản… cần tiếp tục nghiên cứu
và hoàn thiện trong thời gian tớivới rất nhiều yếu tố liên quan trong quá trình chế tạo.
Việc tạo thành công phức hợp kháng thể/nano vàng và khả năng hoạt động rất tốt của
phức hợp này được coi là một trong những kết quả khả quan nhất mà luận văn đã đạt được, tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo hoàn thiện kit chẩn đoán phát hiện virus
cúm A/H5N1 bằng que thử nhanh.
Các kết quả cho thấy các hạt nano vàng với kích thước trung bình 20- 25 nm chứa các nhóm chức carboxyl được gắn với kháng thể có khả năng tóm bắt kháng nguyên kháng virus cúm A/H5N1 thông qua cơ chế bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên- kháng thể dựa trên mô hình dot blot và que thử đơn giản. Dù kết quả còn rất thô sơ
bằng phương pháp que thử đơn giản, tuy nhiên nó bước đầu cho thấy khả năng ứng
dụng vào thực tiễn trong lĩnh vực chẩn đoán nhanh là rất khả quan. Với điều kiện
thực tiễn hiện nay tại Việt Nam, nghiên cứu có thể bước đầu làm cơ sở cho việc sản
xuất các loại kit chẩn đoán nhanh một số bệnh cấp tính lây lan trên diện rộng. Cùng với việc chủ động vật liệu nano vàng, nguồn kháng thể, việc chế tạo và sử dụng rộng
rãi các kit chẩn đoán nhanh với chi phí thấp, thân thiện với người dùng, và đặc biệt là việc sử dụng có tính linh hoạt của kit, cũng như phạm vi sử dụng rộng rãi hứa hẹn
một triển vọng lớn và sẽ đóng một vai trò rất quan trọng trong chế tạo các loại kit
KẾT LUẬNVÀ KIẾN NGHỊ
A. Các kết quả đã đạt được
1. Tìm được các điều kiện thích hợp chế tạo thành công hạt nano vàng (AuNPs) cải tiến theo phương pháp khử của Turkevich, với 80% số hạt có kích thước từ 20-25 nm, hình cầu, đơn phân tánvới đỉnh hấp thụ cực đại ở 523 nm, độ bán rộng khoảng80nm. 2. Phân tích cấu trúc hóa học bằng phổ hồng ngoại FTIR cho thấy các hạt AuNPs có cấu
trúc lõi vàng (Au) với các nhóm chức carboxyl (–COOH) tích điện âm bọc xung
quanh.
3. Tạo thành công phức hợp hạt nano vàng gắn kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 với lượng gắn thích hợp là 3µg kháng thể trong 1ml dung dịch nano vàng tương đương
với 5µg kháng thể trên 36 µg nano vàng với các điều kiện gắn tối ưutại pH= 5 ở nhiệt độ 4oC.
4. Kiểm tra thử nghiệm mô hình que thử đơn giản và Dot blot phát hiện được kháng
nguyên virus cúm A/H5N1bước đầu cho kết quả rất khả quan.
B. Kiến nghị
1. Tiếp tục hoàn thiện quy trình chế tạo phức hợp kháng thể/nano vàng để tạo bộ kit phát
hiện nhanh virus cúm A.
2. Đánh giá độ nhạy, độ bền, điều kiện bảo quản của kitchẩn đoán bằng que thử nhanh.
3. Từ phức hợp kháng thể/nano vàng, có thể gắn các loại kháng thể khác lên hạt nano vàng để tạo nên các kit chẩn đoán các nhiều loại bệnh khác trên nguyên tắc tương tự.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tham khảo nước ngoài
1. Abid, J.P., (2003), "Laser induced synthesis and non linear optical properties of metal nanoparticles, in Laboratorie d’Electrochimie," Ecole Polytechnique Federale de Lausanne.
2. Alivisatos AP, (1996),Semiconductor Clusters, Nanocrystals, and Quantum Dots. Science 271, pp.933-937.
3. Anderson SA, R.R., Westlin WF, Null C, Jackson D, Lanza GM, Wickline SA, Kotyk JJ, , (2000), "Magnetic resonance contrast enhancement of neovasculature with alpha(v)beta(3)-targeted nanoparticles", Magn Reson Med 44, pp.433-439.
4. Bielinska A, E.J., Lee I, Baker JR, Balogh LJ. Imaging {Au0-PAMAM}, , (2002), "Gold-dendrimer Nanocomposites in Cells", Nanopart. Res 4, pp.395-403.
5. Brust. M; M. Walker; D. Bethell; D. J. Schiffrin; R. Whyman, (1994), "Synthesis of Thiol-derivatised Gold Nanoparticles in a Two-phase Liquid-Liquid System", Chem. Commun 801.
6. Buechler, K.F., et el., , (1992), "SIMUTANEOUS DETECTION OF 7 DRUGS OF ABUSE BY THE TRIAGE (TM) PANEL FOR DRUGS OF ABUSE", Clinical Chemistry 38, pp.1678-1684.
7. Cai, W. and X. Chen, (2007), "Nanoplatforms for Targeted Molecular Imaging in Living Subjects", Small 3, pp.1840-1854.
8. Cao, Y.W., R. Jin, C.A. Mirkin, , (2002), "Nanoparticles with Raman spectroscopic fingerprints for DNA and RNA detection", Science 297, pp.1536-1540.
9. Colomban, P., (2009), " The Use of Metal Nanoparticles to Produce Yellow, Red and Iridescent Colour, from Bronze Age to Present Times in Lustre Pottery and Glass: Solid State Chemistry, Spectroscopy and Nanostructure.",Journal of Nano Research 8, pp.109-132.
10. Debye, P., (1909), "Der Lichtdruck auf Kugeln von beliebigem Material",
Ann. Phys 30, pp.57-136.
11. Dongxiang Li, Q.H., Yue Cui, Li Duan, Junbai Li,, (2007), "Immobilization of glucose oxidase onto gold nanoparticles with enhanced thermostability", Science Direct.
12. Feldheim DL, C.A., Marcel D,, (2002), "Metal Nanoparticles: Synthesis, Characterization and Applications.", J. Phys. Chem. B 300, pp.11202- 11208.
13. Frens G., (1972), "Particle size and sol stability in metal colloids", Colloid & Polymer Science 250, pp.736-741.
14. Fuhu Peng, Z.W., Shuhui Zhang, Renwei Wu, Sishun Hu, Zili Li, Xiliang Wang, and Dingren Bi, , (2008), "Development of an Immunochromatographic Strip for Rapid Detection of H9 Subtype Avian Influenza Viruses", Clin Vaccine Immunol 15, pp.569-574.
15. Gussenhoven, G.C., et al., , (2001), "LEPTO distick, a dipstick assay for detection of Leptospira-specific immunoglobulin M antibodies in human sera.", Journal of Clinical Microbiology 35, pp.92-97.
16. Ho, K.-C., et al.,, (2004), " Using biofunctionalized nanoparticles to probe pathogenic bacteria", Anal. Chem, pp.7162-7168.
17. Horrisberger and Clerc (1985), "Labelling of colloidal gold with protein A. A quantitative study", Histochemistry and Cell Biology 82, pp.219- 223.
18. J. Turkevich, P.C.S., J. Hillier, , (1951), "A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold", Discuss. Faraday. Soc 11, pp.55-75.
19. Ji, X., X. Song, et al.,, (2007), "Size Control of Gold Nanocrystals in Citrate Reduction: The Third Role of Citrate", J. Am. Chem. Soc. 129, pp.13939-13948.
20. Jianfeng Chen, M.J., Zhengjun Yu, Hanbing Dan, Anding Zhang, Yunfeng Song and Huanchun Chen, , (2007), "A latex agglutination test for the rapid detection of avian influenza virus subtype H5N1 and its clinical application", Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 19 pp.155-160.
21. Kalogiani, D.P., et al., Dry reagent dipstick test combined with 23S rRNA PCR for molecular diagnosis of bacterial infection in arthroplasty, (2007),Analytical Biochemistry 361, pp.169-175.
22. Khlebtsov, N.G., L.A. Dykman, V.A. Bogatyrev, and B.N. Khlebtsov, (2003), "Two-Layer Model of Colloidal Gold Bioconjugates and Its Application to the Optimization of Nanosensors", Colloid Journal 65, pp.508-518.
23. Khlebtsov, N.G., et al.,, (2003), "Two-layer model of colloidal gold bioconjugates and its application to the optimization of nanosensors",
Colloid Journal 65, pp.508-518.
24. Kimling J , M.M., Okenve B, Kotaidis V, Ballot H, Plech A, , (2006), "Turkevich Method for Gold Nanoparticle Synthesis Revisited", J. Phys. Chem. B 110, pp.15700-15707.
25. Kottmann, J., P., Martin, O., J., F., Smith, D., R., Schultz, B , . , (2001),S. Physical Review 64, p402.
26. Kreibig U, V.M., (1995. ), "Optical Properties of Metal Clusters",
Springer 25, pp.532-538.
27. Kress-Rogers, E., Phil, D., , "Handbook of biosensors and electronic noses. Medicine, food and the environment.", pp.149-168.
28. Le, Q.M., M. Kiso, K. Someya, Y.T. Sakai, T.H. Nguyen, K.H.L. Nguyen, N.D. Pham, H.H. Ngyen, S. Yamada, Y. Muramoto, T. Horimoto, A. Takada, H. Goto, T. Suzuki, Y. Suzuki, and Y. Kawaoka, (2005), "Avian flu: Isolation of drug-resistant H5N1 virus", Nature 437, pp.1108-1108.
29. Leff DV, B.L., and Heath JR,, (1996), "Synthesis and Characterization of Hydrophobic, Organically-Soluble Gold Nanocrystals Functionalized with Primary Amines", Langmuir 12, p4723.
30. Leuvring, J.H.W., et al., , (1980), "SOL PARTICLE AGGLUTINATION IMMUNOASSAY FOR HUMAN CHORIONIC-GONADOTROPIN",
Fresenius Zeiftschrift Fur Analytische Chemie 301, pp.132-133. 31. Liao, H., Nehl, C., L., Hafner, J., H. ,, (2006),Nanomedicine 1, p201. 32. Link S, E.-S.M., (2005), "Additions and corrections to “Simulation of the
optical absorption spectra of gold nanorods as a function of their aspect ratio and the effect of the medium dielectric constant", J. Phys. Chem. B
109, pp.10531-10532.
33. Link S, E.-S.M., (2003), "Optical properties and ultrafast dynamics of metallic nanocrystals", Annu. ReV. Phys. Chem 54, pp.331-366.
34. Liz-Marza ´n, L.M., M. Giersig, P.Mulvaney, , (1996), "Synthesis of nanosized gold-silica core-shell particles", Langmuir, 12, pp. 4329-4335. 35. Lonnberg, M.a.J.C., (2001), "Quantitative detection in the attomole range
for immunochromatographic tests by means of a flatbed scanner",
Analytical Biochemistry 293, pp.224-231.
36. M.-C. Daniel, D.A., (2004), "Gold nanoparticles: assembly, supramolec- ular chemistry, quantum-size-related properties, and applications
toward biology, catalysis, and nanotechnology", Chem. Rev. 104, pp.293-346. 37. M. Brust; M. Walker; D. Bethell; D. J. Schiffrin; R. Whyman, (1994),
"Synthesis of Thiol-derivatised Gold Nanoparticles in a Two-phase Liquid-Liquid System",Chem. Commun 801.
38. M. Faraday, (1857), "Experimental relations of gold (and other metals) to light", London: Richard Taylor & William Francis, pp.391-442.
39. M.N. Martin; J.I. Basham; P. Chando; S.-K. Eah, (2010), "Charged gold nanoparticles in non-polar solvents: 10-min synthesis and 2D self- assembly", Langmuir 26, p7410.
40. Martin, M.N., J.I. Basham, P. Chando, and S.-K. Eah, (2010), "Charged Gold Nanoparticles in Non-Polar Solvents: 10-min Synthesis and 2D Self- Assembly", Langmuir 26, pp.7410-7417.
41. Mie, G., (1908), "Beitra ¨ge zur Optik tru ¨ber Medien speziell kolloidaler Metallo", Ann. Physik 25, pp.377-445.
42. Nath, N. and A. Chilkoti, (2001), "Interfacial Phase Transition of an Environmentally Responsive Elastin Biopolymer Adsorbed on Functionalized Gold Nanoparticles Studied by Colloidal Surface Plasmon Resonance", Journal of the American Chemical Society 123, pp.8197- 8202.
43. Niemeyer, C.M., (2003), "Functional hybrid devices of proteins and inorganic nanoparticles", Angew. Chem. Int. Ed 42, pp.5796-800.
44. Niemeyer CM, A., ( 2001), "Nanoparticles, Proteins, and Nucleic Acids: Biotechnology Meets Materials", Science Chem. Int. Ed 40, pp.4128- 4158.
45. Oberdorster, G., Maynard, A., Donaldson, K., Castranova, V., Fitz- patrick, J., Ausman, K., Carter, J., Karn, B., Kreyling,W., Lai, D.,Olin, S., Monteiro-Riviere, N., Warheit, D., Yang, H., , (2005),Part Fibre Toxicol 2, pp.8-43.
46. Oku, Y., et al, (2001), "Development of Oligonucleotide lateral-flow immunoassay for multi-parameter detection", Journal of Immunological Methods 258, pp.73-84.
47. Olofsson L, R.T., Pfeiffer I, Kall M, and Hook F, , (2003), "Surface- Based Gold-Nanoparticle Sensor for Specific and Quantitative DNA Hybridization Detection", Langmuir 19, pp.10414-10419.
48. Paciotti, G.F., L. Myer, D. Weinreich, D. Goia, N. Pavel, R.E. McLaughlin, and L. Tamarkin, Colloidal gold: a novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery.
49. Reddy, V.R., (2006), "Gold Nanoparticles: Synthesis and Applications",
Synlett 2006, pp.1791,1792.
50. Riu, J., Marato, A., Rius, F., X. Talanta,, (2006), 69, p288.
51. S.D. Perrault; W.C.W. Chan, (2009), "Synthesis and Surface Modification of Highly Monodispersed, Spherical Gold Nanoparticles of 50-200 nm",
J. Am. Chem. Soc 131, p17042.
52. Sanford JC, S.F., and Russell JA,, (1993), "Optimizing the biolistic process for different biological applications", Methods Enzymol 217, pp.483-509.
53. Smith, G., (1985), "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface", Science 228, pp.1315- 1317.
54. Sperling, R.A., P. Rivera Gil, F. Zhang, M. Zanella, and W.J. Parak, (2008), "Biological applications of gold nanoparticles", Chemical Society Reviews 37, pp.1896-1908.
55. Stöber, W., A. Fink, E. Bohn, , (1968), "Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range", J. Colloid Interface Sci. 26, pp.62-69.
56. Tsuda, S., et al, (1992),Plant Disease 76, pp.466-469.
57. Turkevich, J., R.S. Miner, and L. Babenkova, (1986), "Further studies on the synthesis of finely divided platinum", The Journal of Physical Chemistry 90, pp.4765-4767.
58. Turkevich, J.S., P. C.; Hillier. J,, (1951), "Nucleation and Growth Process in the Synthesis of Colloidal Gold", Discuss. Faraday Soc 11, pp.55-75. 59. Zayrseva, N.V., et al, (2004), "Multi-analyte single membrane biosensor
for serotype-specific detection of Dengue virus.", Ananlytical and Bioanalytical Chemistry 380, pp.46-53.
Các website
60. http://www.thebritishmuseum.ac.uk/science/lycurguscup/sr-lycugus p1.html
61. http://www.mrsec.wisc.edu/Edetc/background/quantum_dots/index.html 62. http://www.webexhibits.org/causesofcolor/9.html
63. http://microgravity.hq.nasa.gov/general_info/homeplanet_lite.html 64. http://www.mrsec.wisc.edu/Edetc/nanolab/gold/index.html
PHỤ LỤC