thể/nano vàng)
Sau khi tìm được pH tối ưu cho việc gắn kháng thể kháng virus cúm A lên bề
mặt hạt nano vàng, chúng tôi tiến hành tạo phức hợp kháng thể/nano vàng. Việc gắn
kháng thể lên bề mặt hạt nano vàng dựa trên phản ứng liên kết giữa nhóm chức
carboxyl (–COOH ) với nhóm NH2 trên phân tử kháng thể để tạo liên kết amide bền
vững.Quy trình gắn có thể được mô tả như trên hình 2.6. Kháng thể đơn dòng sau khi
đã tinh sạch được nhỏ vào dung dịch chứa các hạt nano vàng ở pH thích hợp. Phản ứng lên kết giữa nhóm carboxyl trên bề mặt hạt nano và nhóm amine trên phân tử
kháng thể tạo nên một liên kết cộng hóa trị bền. Sau đó, bovine serum albumine (BSA) được nhỏ thêm vào dung dịch gắn nhằm lấp đầy các vị trí trống trên bề mặt hạt
nano sau khi các phân tử kháng thể đã gắn lên bề mặt hạt. Vai trò của BSA giúp ngăn
chặn việc bắt cặp không đặc hiệu trên bề mặt hạt vàng khi phản ứng đặc hiệu giữa
kháng nguyên-kháng thể xảy ra.
Hình 2.6. Quy trình gắn kháng thể với hạt nano vàng
Quy trình cụ thể như sau:
- Bước 1: Trước khi tiến hành phản ứng gắn, đem ly tâm dung dịch nano vàng ở
3000rpm/10 phút để loại bỏ các hạt lớn, thu phần dung dịch nổi chứa các hạt nano
- Bước 2. Kháng thể được pha loãng trong dung dịch PBS (sodium phosphate buffer) 1x pH 7.4 tới nồng độ kháng thể100 µg/ml.
- Bước 3: Tiếp theo cho từnglượng thể tích khác nhau từ 10µl đến 100 µl dung dịch
kháng thể đã pha vào 1ml dung dịch AuNPs (sau khi chỉnh pH thích hợp) và đảo đều trong 15 phút.
- Bước 4: Sau đó, 100 µl BSA (bovine serum albumine) 2% được nhỏ vào 1 ml dung dịch AuNPs đã gắn kháng thể. Đảo đều và ủ trong 1h ở 40C. BSA được sử
dụng để lấp đầy các vùng không liên kết bởi kháng thể, nhằm ngăn chặn sự bắt
cặp không đặc hiệu với kháng nguyên (non-specific binding sites).
- Bước 5: Dung dịch gắn được ly tâm ở 8000 rpm/15 phút, thu tủa, loại bỏ phần
dịch nổi. Phần tủa chính là các hạt vàng đã gắn kháng thể và được block bằng
BSA.
- Bước 6: Rửa phần tủa thu được một lần nữa bằng dung dịch PBS chứa 2% BSA,
sau đó thu lại bằng li tâm ở 8000rpm/10 phút, thu tủa, loại bỏ dịch.
- Bước 7: Hòa tan tủa trong 100µl dung dịch đệm (0.01M Tris, 5% BSA, 2% sucrose, 0.87% NaCl and 0.1M natri azide) và bảo quản ở 40C.
Để tìm được lượng gắn tối ưu, chúng tôi sử dụng các lượng kháng thể khác
nhauđược nhỏ vào dung dịch nano vàng. Sau thời gian gắn 15 phút, một lượng NaCl (100µl) được nhỏ vào từng ống để kích thích sự kết tủa của các hạt nano vàng. Ống nào chưa đủ lượng kháng thể gắn với các hạt nano vàng, chúng sẽ bị NaCl kích thích
sẽ làm mất cân bằng năng lượng bề mặt và tạo kết tủa. Ống dung dịch nào có bắt đầu đủ lượng kháng thể gắn lên bề mặt của các hạt, chúng sẽ trở nên trạng thái cân bằng
bền khi có sự kích thích của NaCl. Dung dịch chứa các hạt nano sẽ không bị co cụm
và trong trường hợp này không bị mất màu. Để tìm ra lượng kháng thể chính xác,
chúng tôi tiến hành đo phổ hấp thụ UV/vis cho từng ống dung dịch để quyết định.