- Máy khuấy từ gia nhiệt Van điều chỉnh
3.2.3 Quy trình cố định enzyme lên bề mặt hạt nano từ trong đề tà
Để tạo chế phẩm enzyme cố định có nhiều phương pháp khác nhau. Tuy nhiên, với vật liệu chất mang là các hạt oxit sắt từ kết hợp với agarose hoặc alginate thì việc cố định enzyme lên hạt sắt được thực hiện bằng phương pháp bọc trong gel agarose hoặc gel alginate tương ứng. Phương pháp này hết sức đơn giản và dễ thực hiện. Agarose và alginate sẽ như một lớp màng bao bọc hạt sắt và enzyme lại.
88
Tuy nhiên phải xác định được được nồng độ agarose/ algiante thích hợp cho việc bọc (cố định) đạt hiệu quả, nghĩa là không làm mất tính chất siêu thuận từ của sắt từ mà vẫn bọc được enzyme và hạt sắt. Nên ta cố định nồng độ của dịch sắt từ và enzyme còn thay đổi nồng độ của agarose và alginate để tìm ra nồng độ bọc thích hợp [36,39].
3.2.3.1 Đối với vật liệu tạo gel là agarose
Cách tiến hành:
- Pha dung dịch Fe3O4 0,6% [36] bằng cách siêu âm trong 15 phút [5], dung dịch enzyme được pha loãng 4 lần (trong dung dịch đệm phosphate pH = 7,51, 0,05M đối với enzyme protease, và trong nước cất đối với enzyme amylase), dung dịch stock agarose 1,2% đem đi hấp khử trùng.
- Hút 10 ml Fe3O4 0,6% thêm 10ml enzyme đem lắc đều trong 1giờ, mục đích để tạo điều kiện cho enzyme hấp phụ lên bề mặt hạt sắt từ [39].
- Sau đó thêm 10 ml agarose với các nồng độ khác nhau cho vào hỗn hợp trên lắc đều trong 1 giờ trong điều kiện nhiệt độ phòng (250C). - Sau đó rửa sạch bằng nước cất rồi dùng nam châm thu sản phẩm. - Kiểm tra sản phẩm tạo thành.
- Bảo quản sản phẩm tạo thành trong dung dịch đệm pH = 7,51 trong tủ lạnh.
3.2.3.2 Đối với vật liệu tạo gel là alginate
Cách tiến hành cũng tương tự như đối với quá trình bọc bằng agarose, tuy nhiên dung dịch enzyme được pha loãng 4 lần trong nước cất và thay agarose bằng alginate (stock 2%):
89
- Sau khi enzyme là sắt từ được lắc đều trong 1 giờ, thêm 10ml alginate với các nồng độ khác nhau và tiếp tục lắc đều trong 1 giờ ở điều kiện nhiệt độ phòng (250C).
- Sau đó bổ sung 10 ml CaCl2 3,5% để tạo màng [4]. - Rửa lại bằng nước cất và thu sản phẩm tạo thành. - Kiểm tra sản phẩm tạo thành.
- Bảo quản trong tủ lạnh 40C.
Sản phẩm tạo thành có thể theo các hướng sau: enzyme và hạt sắt cùng được bọc trong agarose hay alginate, hoặc enzyme và hạt sắt không cùng được bọc hay bọc enzyme mà không bọc sắt từ…, do đó để thu hồi sản phẩm ta dùng nam châm để giữ sản phẩm lại, rửa lại nhiều lần bằng nước cất, và sau đó kiểm tra sản phẩm tạo thành có gắn được enzyme hay không bằng cách đem thử hoạt tính bằng phương pháp Anson cải tiến nhưng không có cystein đối với emzyme protease, còn đối với amylase thì được thử hoạt tính bằng phương pháp đường khử Bernfeld.
90
Chương 4.NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG ĐO ĐẠC VÀ PHÂN TÁCH CÁC PHÂN TỬ SINH HỌC