- Máy khuấy từ gia nhiệt Van điều chỉnh
T tr ng ngoài
4.7.2 Phân tách lượng hoạt chất đã đánh dấu
Trên thực tế, quá trình gắn kết các PTSH lên hạt nano đã bao gồm việc phân tách các PTSH ngay từ ban đầu. Quy trình đã báo cáo trong Chương 2 cho việc gắn kết các PTSH có thể được tóm tắt ngắn gọn theo trình tự sau: (0) bước chuẩn bị tác nhân từ tính: tạo lớp CHHBM cho hạt nano từ sau đó tạo liên kết với một loại kháng thể (kháng thể bậc hai) có liên kết đặc hiệu với lớp CHHBM hạt nano; (1) tạo màng đế và cố định một loại kháng thể thứ nhất lên màng đế; (2) kháng nguyên đặc hiệu (cần thu nhận và đo đạc) liên kết với kháng thể cố định, các kháng nguyên hoặc thành phần khác còn lại trong dung dịch được loại khỏi dung dịch; (3) đưa kháng thể bậc hai có sẵn liên kết với hạt nano từ đã chuẩn bị từ bước (0) vào dung dịch để tạo liên kết với kháng nguyên đã cố định; (4) khi cả mẫu được đặt trong từ trường ngoài, các hạt nano từ sẽ được định hướng trong từ trường ngoài. Quy trình này có thể được mô phỏng theo Hình 4.39.
Hình 4.39. Lược đồ Quy trình gắn kết kháng nguyên với hạt nano từ lên màng đế.
Kháng nguyên Kháng thể Kháng thể bánh kẹp Hạt nano từ có CHHBM Đế (2) (1) (3) (4) Từ trường +
143
Như vậy, theo quy trình đó thì bước thứ (2) đã thực hiện việc chọn lọc riêng các kháng nguyên cần quan tâm và gắn cố định chúng lên kháng thể cố định, các thành phần sinh học khác không có liên kết đặc hiệu với kháng thể cố định đã được loại bỏ ngay sau bước thực nghiệm đó. Điều đó dẫn tới trong dung dịch chỉ còn lại kháng thể cố định gắn với kháng nguyên cần quan tâm. Do đó việc phân tách đã được thực hiện.
Tuy nhiên, khi xét một bài toán y sinh tổng quát hơn ở đó một dung dịch sinh hóa nào đó có chứa một lượng hoạt chất chưa biết nồng độ, thì quy trình phân tách được tiến hành theo 2 bước: (i) Xác định nồng độ hoạt chất bằng hệ thống đo đã xây dựng. Để đo đạc được nồng độ đó thì quy trình gắn kết nêu trên sẽ được thực hiện với một lượng mẫu nhỏ lấy ra từ dung dịch sinh hóa; (ii) Phân tách hàm lượng: do nồng độ hoạt chất đã được xác định từ bước (i) nên hàm lượng của hoạt chất sinh học trong toàn bộ thể tích dung dịch sinh hóa đó được chỉ ra. Từ kết quả này, một lượng hạt nano từ có sẵn liên kết với kháng thể bậc hai đã được chuẩn bị từ trước được đưa vào dung dịch. Liên kết hóa sinh giữa kháng thể bậc hai có gắn hạt nano và PTSH (kháng nguyên quan tâm) được hình thành. Qua quá trình này, do lượng hạt nano có liên kết với kháng thể bậc hai là dư trong dung dịch nên toàn bộ lượng chất hoạt hóa cần phân tách sẽ tạo liên kết với hạt nano. Do có liên kết chặt với các hạt nano nên chỉ cần một gradient từ trường vừa đủ đặt bên ngoài thành bình chứa là có thể kéo tất cả các hạt nano có gắn hoạt chất về phía thành bình. Các thành phần còn lại của dung dịch không bị hút về thành bình sẽ được lấy ra khỏi dung dịch dễ dàng và không bao gồm hoạt chất cần phân tách. Quy trình phân tách này có thể được biểu diễn qua Hình 4.40.
144
Hình 4.40. Quy trình phân tách trong dung dịch. (1): dung dịch chứa kháng thể bậc
1 có gắn PTSH cần phân tách; (2) dung dịch chứa hạt nano từ có gắn kháng thể bậc
2; PMN: nam châm vĩnh cửa.
Cấu tạo của bộ phận phân tách bao gồm 4 nam châm vĩnh cửu đặt trong một giá cố định. Phần giữa giá để chừa một không gian để có thể đặt vừa vặn bình chứa dung dịch sinh hóa vào đó. Sơ đồ mặt cắt bộ phận phân tách bằng từ trường và nguyên lý phân tách được chỉ ra trên Hình 4.41. Do đặc tính của hạt nano từ là có từ tính khi có từ trường và mất hoàn toàn từ tính khi không đặt trong từ trường, nên khi xuất hiện một gradient từ trường ở lân cận, các hạt nano sẽ nhanh chóng bị từ hóa và bị hút về phía gradient từ trường lớn hơn [133]. Hình 4.41. Mặt cắt bộ phận phân tách bằng từ trường. (PMN: nam châm vĩnh cửu) PMN PM N Lấy ra Ghim lại
145
Hình 4.42. Hình ảnh bộ phận phân tách đã thiết kế chế tạo.
Như vậy, theo nguyên tắc phân tách này, khi bình dung dịch chứa các hạt nano từ có liên kết với hoạt chất cần phân tách được đưa vào bộ phận phân tách, các hạt nano sẽ được hút ra thành bình bởi từ lực của 4 nam châm vĩnh cửu đặt xung quanh và bên ngoài thành bình, do vậy lượng hoạt chất gắn trên các hạt nano cũng được kéo theo về thành bình. Lượng hạt này sẽ được ghim lại nhờ từ lực trong suốt quá trình loại bỏ/chiết tách các thành phần còn lại ra khỏi dung dịch. Tùy theo mục đích khác nhau của việc phân tách mà lượng giữ lại sẽ được xử lý thích hợp. Ví dụ như hoạt chất cần phân tách là các virut gây bệnh chưa xác định hoặc mầm bệnh trong tế bào [134], thì lượng chất giữ lại được tiếp tục nghiên cứu để tìm hiểu bản chất mầm bệnh. Lúc đó, các liên kết giữa hạt nano từ và hoạt chất cần phải được giải phóng bằng các phương pháp hóa sinh tương thích với bản chất liên kết của từng loại.
Để đánh giá hiệu quả của phương pháp sử dụng hạt nano sắt từ phân tách các phân tử sinh học đặc hiệu, chúng tôi tách protein IgM của bò (Bovine IgM) ra khỏi dung dịch mẫu sử dụng hạt nano sắt từ gắn kháng thể cho IgM
146
và thiết bị tách từ (trình bầy trong hình vẽ thiết kế). Các hóa chất sử dụng ở đây là:
• Kháng thể cho Bovine IgM, 1 ml.
• Huyết thanh chuẩn của bò (Bovine Reference Serum) có chứa 1,8 mg/ml IgM.
Các hóa chất này được đặt mua từ hãng Sigma-Aldrich (Hoa Kỳ). Kháng thể cho Bovine IgM được gắn lên hạt nano sắt từ theo phương pháp trình bày ở Chương 3. Từ dung dịch huyết thanh chuẩn của bò, chúng tôi pha loãng ra các dung dịch thử có 4 mức nồng độ khác nhau là: 1000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml. Các dung dịch này được đưa vào thiết bị phân tách sử dụng hạt nano từ tính có gắn kháng thể đặc hiệu cho IgM. Nhờ vào tương tác đặc hiệu giữa kháng thể và IgM mà các phân tử IgM được giữ lại với các hạt nano sắt từ. Nhờ từ trường, chúng tôi tách ra các hạt nano sắt từ này và sau 3 lần rửa bằng dung dịch đệm phosphate 0,1M và pH = 7,2, chúng tôi thu được IgM tinh sạch gắn với hạt nano sắt từ. Sau đó chúng tôi thu hồi riêng IgM bằng phương pháp tăng nhiệt đến 60oC trong dung dịch đệm Na citrate (10 mM Na citrate, 0,05% Tween 20, pH = 6,0). Dung dịch IgM thu được qua phép thử Bradford để xác định hàm lượng protein thu hồi được.
Mặc dù các hạt nano từ bị hút về phía có gradient từ trường mạnh nhưng vẫn tồn tại một xác suất nhỏ nào đó số ít các PTSH hoạt chất không thể phân tách. Theo nguyên tắc phân tách bằng từ trường này, hiệu suất của phương pháp phụ thuộc chủ yếu vào hai yếu tố: độ mạnh (hay tính đặc hiệu) của liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể, và hiệu suất thu hồi pha rắn của tập hợp các cặp liên kết PTSH-hạt nano từ. Có thể có 2 nguyên nhân dẫn tới vấn đề này. Thứ nhất là việc gắn kết giữa hạt nano có phủ lớp CHHBM với PTSH hoạt chất diễn ra trong dung dịch cũng tồn tại một xác suất không thành công nhỏ. Thứ hai là độ linh động của hạt nano có gắn kết với các phân
147
tử hoạt chất phụ thuộc vào độ nhớt của dung môi chứa chúng, theo đó độ lớn của gradient từ trường không phù hợp với độ nhớt của dung môi làm cho hiệu suất hấp dẫn của từ lực lên hạt nano giảm đi. Việc xác định và đánh giá hiệu suất phân tách sẽ được báo cáo trong Chương 5.
148
Chương 5. KẾT QUẢĐO ĐẠC VÀ PHÂN TÁCH 5.1 Đo đạc đánh giá kết quả của các phép đo của bộ cảm biến
Các phép đo đạc thực nghiệm để khảo sát thuộc tính của bộ cảm biến đã nghiên cứu chế tạo bao gồm:
- Đo đạc, kiểm tra và đánh giá kết quả cho các mẫu có gắn các PTSH (protein hoặc ADN) với cùng một lượng hạt nano ban đầu để kiểm chứng sự giao thoa từ trường (nếu có) của đối tượng đo.
- Đo đạc và xác định đường chuẩn tín hiệu từ trường tương ứng với nồng độ hạt nano từ khác nhau có mặt trong dung dịch.
- Đo đạc kết quả cho các hệ sinh học gắn protein và gắn ADN.