- Máy khuấy từ gia nhiệt Van điều chỉnh
T tr ng ngoài
5.1.3 Đường chuẩn và đặc trưng tuyến tính
Việc xác định đường chuẩn cho phép đo từ trường của các hạt nano từ tương ứng với hàm lượng hạt nano từ khác nhau có mặt trong dung dịch là công việc đầu tiên trong quá trình đo đạc các tham số hàm lượng.
Quy trình đo đạc đường chuẩn này được tiến hành theo các bước sau:
5.1.3.1 Chuẩn bị các mẫu chuẩn hạt nano từ
Chuỗi các mẫu chuẩn hạt nano từ là các mẫu chất lỏng từ có đặc điểm nồng độ hạt nano của các mẫu liên tiếp nhau sai khác nhau một bội số bậc 2, tức là một mẫu nào đó sẽ có nồng độ gấp đôi mẫu trước đó và bằng một nửa mẫu kế sau nó. Để thực hiện được yêu cầu này, thông thường người ta tạo ra mẫu đầu tiên với nồng độ hạt nano nhỏ nhất mà phương pháp hóa học có thể đo đếm được. Trong nghiên cứu này, lượng hạt nano từ được xác định theo nồng độ khối lượng-thể tích, tức khối lượng hạt trên một đơn vị thể tích dung dịch. Như vậy, mẫu đầu tiên sẽ được chuẩn bị với lượng mẫu hạt nano nhỏ nhất mà dụng cụ đo (cân) có thể đo được sẽ được lấy ra đưa vào một lượng dung môi (nước cất) cố định. Mẫu tiếp theo sẽ được tiếp tục tạo ra với một lượng hạt nano bằng 2 lần lượng hạt mẫu thứ nhất vừa chuẩn bị và cũng được cho vào cùng một lượng nước cất như vậy. Quy trình chuẩn bị này tiếp tục lặp lại để tạo ra một số lượng mẫu mong muốn cho quy trình đo đạc đường chuẩn.
Trên thực tế, 16 mẫu đã được tạo ra theo cách trên. Lưu ý là có hai loại hạt nano từ, có và không có lớp bọc SiO2 đã được nghiên cứu chế tạo (theo báo cáo chuyên đề 1), nên hai chuỗi mẫu tương ứng với hai mẫu hạt này được chuẩn bị để xác định 2 đường chuẩn. Bảng 5.2 trình bày thông số hàm lượng của các mẫu hạt nano dùng để xác định các đường chuẩn.
153
Bảng 5.2. Các mẫu hạt nano từ (không gắn PTSH) để xác định đường chuẩn
Mẫu a*) 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a Nồng độ (mg/ml) 0.084 0.169 0.338 0.675 1.35 2.7 5.4 10.8 Mẫu b 1b 2b 3b 4b 5b 6b 7b 8b Nồng độ (mg/ml) 0.14 0.28 0.56 1.12 2.24 4.48 8.96 17.92
*) Mẫu a: các hạt nano từ không bọc lớp SiO2; Mẫu b: các hạt nano từ có lớp bọc SiO2.
5.1.3.2 Thiết lập chếđộđo
Tất cả các mẫu đã chuẩn bị sẽ được đo đạc với cùng một chế độ đo, bao gồm các thông số cố định: tần số quét mẫu qua cảm biến 1,0 Hz, từ trường hiệu dịch 800 A/m (nam châm điện), từ trường từ hóa 256 kA/m (nam châm vĩnh cửu), nhiệt độ phòng và các yếu tố giao thoa điện từ.
Kết quả đo đạc đường chuẩn được trình bày trên Hình 5.2 và Hình 5.3 tương ứng cho 2 mẫu a và mẫu b trên Bảng 5.2. Trên thực tế, lối ra của cảm biến (tính theo mV) không nhất thiết phải chuẩn hóa thành đơn vị từ trường (A/m) với lý do được giải thích trong phần nội dung bên dưới. Vì vậy, cách đơn giản nhất là giữ nguyên lối ra và xây dựng đường chuẩn theo đơn vị mV.
154 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 R: 0.99927 SD: 17.6376 Output, U (mV) Concentration, X (mg/ml) Exp
Linear fit: U = 117.82X, Err: 1.41
Hình 5.2. Đường chuẩn cho mẫu hạt nano không có lớp bọc SiO2.
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200 0 500 1000 1500 2000 R: 0.99982 SD: 11.2870 Output, U (mV) Concentration, X (mg/ml) MNP+SiO2 Exp
Linear fit: U = 96.46X, Err: 0.55
155
Kết quả cho thấy, đường chuẩn có dạng tuyến tính tốt cho cả hai loại hạt nano có và không có lớp bọc SiO2. Các đường thẳng trên hai đồ thị biểu diễn đường làm khớp tuyến tính đi qua gốc tọa độ (0) của các điểm thực nghiệm. Từ đó có thể nhận thấy sự phù hợp rất tốt của đường chuẩn với đường làm khớp thông qua hệ số R. Cũng có thể nhận ra rằng các mẫu hạt có bọc lớp SiO2 cho đường chuẩn có mức độ tuyến tính tốt hơn so với các mẫu không có lớp bọc SiO2. Kết quả này đã được giải thích trong các nghiên cứu trước đây về mẫu hạt nano mà nguyên nhân chính là sự phân tán rất tốt của hạt nano khi có lớp bọc SiO2 trong dung môi (trong trường hợp này là nước cất) đã làm cho từ tính của các hạt đồng đều hơn, không bị kết đám như trường hợp các hạt không có lớp bọc SiO2. Xét về độ lớn từ trường cảm ứng (hay từ độ của mẫu), các hạt nano không bọc lớp SiO2 lại cho giá trị trường cảm ứng lớn hơn so với các hạt có lớp bọc SiO2. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với các phép đo từ cho hai loại hạt này như đã trình bày trong Chương 2 (xem Hình 2.23).
Tuy nhiên, các kết quả đường chuẩn này mới chỉ là những kết quả ban đầu nhằm đánh giá khả năng làm việc của cảm biến nên dải đo còn rất hạn chế. Đường chuẩn cần tiếp tục được thực hiện ở dải đo rộng hơn và với các giá trị nồng độ mẫu đo gần nhau hơn để có được đường chuẩn chính xác hơn và ít sai số hơn.
Từ hai phép đo quan trọng nêu trên, việc đo đạc hàm lượng các phân tử sinh học (protein/ADN) có thể được tiến hành dễ dàng theo cách đo trực tiếp hoặc gián tiếp. Đo trực tiếp là phép đo trên các mẫu hạt đã gắn kết với protein/ADN để xác định hàm lượng của protein/ADN. Đo gián tiếp là phép đo từ của nồng độ các hạt nano từ không gắn kết với protein/ADN, sau đó kết hợp với tỷ lệ gắn kết giữa hạt nano-protein/ADN để từ đó suy ra hàm lượng protein/ADN cần đo. Có thể hiểu hai quá trình đo này qua lược đồ nguyên tắc Hình 5.4.
156
Hình 5.4. Lược đồ nguyên tắc đo gián tiếp (1) và trực tiếp (2).
Theo lược đồ nguyên tắc này, phương pháp đo gián tiếp được xác định thông qua quá trình (1), tức là thông qua lượng hạt nano từ (tính theo mg/ml) đã được xác định từ đường chuẩn. Cụ thể là từ một giá trị đo được (chưa biết trước độ lớn), chúng ta đối chiếu với đường chuẩn lối ra sensor-nồng độ hạt nano đã xác định trước đó, sẽ thu được một nồng độ hạt nano tương ứng. Tỷ lệ gắn kết của PTSH với hạt nano là một giá trị cụ thể đã được xác định thông qua đặc điểm của liên kết đặc hiệu của PTSH đó với hạt nano. Từ tỷ lệ này có thể suy ra hàm lượng PTSH đã gắn với hàm lượng hạt nano vừa đo được và đó cũng là kết quả đo cuối cùng. Trường hợp đo trực tiếp, được xác định theo quy trình (2), đơn giản hơn, đó là quá trình đo sau khi các PTSH đã gắn kết với các hạt nano từ và phép đo được tiến hành trực tiếp trên mẫu chứa các liên kết đó. Do các PTSH đã được chứng minh là không gây ảnh hưởng tới tín hiệu đo từ trường cảm ứng của hạt nano, nên tín hiệu thu được từ hàm lượng hạt nano có mặt trong mẫu qua thông số tỷ lệ gắn kết (giữa PTSH và hạt nano) sẽ cho kết quả đo hàm lượng PTSH.
L ố i ra c ả m bi ế n (V) Hàm lượng hạt nano (mg/ml) Hàm lượng PTSH (mg/ml) Điểm thực nghiệm (1) (2) Đường chuẩn
157
Trong nghiên cứu này, do điều kiện thời gian hết sức hạn chế nên các phép đo được tiến hành theo phương pháp đo gián tiếp (do phải tiến hành song song giữa đo đạc và gắn kết sinh học). Để có thể đo được chính xác hàm lượng hoạt chất (protein/ADN) trong dung dịch, độ lớn tín hiệu đo được ở lối ra của sensor cần được quy đổi thành thông số hàm lượng hoạt chất cần xác định. Để làm được điều này, sensor từ phải được chuẩn hóa sử dụng các hệ đo tiêu chuẩn đã có. Ở đây, chúng tôi sử dụng hệ đo tiêu chuẩn của phương pháp ELISA đã được kiểm chứng. Do nguyên tắc liên kết 1-1 giữa hạt nano từ và phân tử hoạt chất sinh học, số phân tử hoạt chất cần xác định bằng với số hạt từ liên kết với chúng. Kết quả đo từ trường cảm ứng (lối ra của cảm biến tính theo mV) được đối chiếu với đường chuẩn và với tỷ lệ gắn kết cụ thể của mẫu để thu được kết quả đo hàm lượng PTSH (tính theo mg/ml). Các mẫu đo đã chuẩn bị như trình bày trong Bảng 5.1 trên đây. Mỗi mẫu được lặp lại 3 lần ở mỗi phương pháp đo. Kết quả cho thấy độ phân giải của phương pháp đo tín hiệu từ ở đây hoàn toàn tương đương với phương pháp ELISA trong điều kiện thường.