Nhằm tìm hiểu khả năng giết vi khuẩn S. mutans của hai dịch chiết từ thân
xoài, lá xoài và lá cây Lấu Ba Vì, chúng tôi đã tiến hành xử lý tế bào chủng S. mutans 74 bằng các dịch chiết tại hai giá trị pH bằng 4,0 và 7,0.
3.1.2.1. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 4,0
Thí nghiệm được tiến hành ở pH 4,0, giá trị pH bắt đầu gây mòn men răng. Đây là môi trường mà vi khuẩn S. mutans có khả năng sinh trưởng tốt, trong khi các chủng vi khuẩn khác kém phát triển [23].
Luận văn thạc sĩ 45
Hình 6. Khả năng giết vi khuẩn S.mutans của các dịch chiết tại pH 4,0
Kết quả ở hình 6 cho thấy, với nồng độ 15%, thời gian 90% quần thể tế bào vi khuẩn bị giết chết tương ứng với giá trị logN/No= -1 lần lượt là hơn 13 phút đối với dịch chiết thân xoài và với dịch chiết lá xoài là 19 phút. Đối với dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì (LAU), 50% quần thể tế bào bị giết sau khoảng 20 phút xử lý. So sánh với các kết quả nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố về dịch chiết một số nguồn thực vật khác như từ vỏ quả măng cụt [18], vỏ sao đen và lá sắn thuyền [7, 17] cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thân xoài và lá xoài là cao hơn.
3.1.2.2. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 7,0
Giá trị pH 7,0 là giá trị pH trung tính trong khoang miệng và được chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các dịch chiết. Kết quả cho thấy ở pH 7,0, các dịch chiết cũng có tác dụng diệt vi khuẩn S. mutans. Tuy nhiên, so với khả năng diệt khuẩn ở pH 4,0 thì khả năng giết vi khuẩn ở pH 7,0 thấp hơn với cùng một nồng độ dịch chiết. Thời gian để diệt 50% số lượng tế bào trong quần thể vi khuẩn S. mutans 74
Luận văn thạc sĩ 46 xoài, lá xoài lần lượt là 23 phút và 25 phút thì 90% số lượng tế bào trong quần thể bị tiêu diệt (Hình 7).
So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [10, 11] cho thấy dịch chiết ethanol từ lá xoài, thân xoài và lá cây Lấu Ba Vì đều có khả năng giết S. mutans 74 thấp hơn so với dịch chiết từ cây Sao đen hay sắn thuyền. Tuy nhiên, đây là kết quả nghiên cứu trên đối tượng là vi khuẩn S. mutans 74, chủng vi khuẩn được phân lập từ người Việt Nam.
Hình 7. Khả năng giết vi khuẩn S. mutans 74 của các dịch chiết tại pH 7,0
3.1.3. Khả năng kết hợp dịch chiết với một số chất bảo vệ răng miệng thông qua khả năng ức chế sự sinh axit
Tổ chức Y tế thế giới đã khuyến cáo nên sử dụng fluor để bảo vệ răng miệng. Thông dụng nhất là hợp chất của flour ở dạng muối NaF hay peroxit hydro H2O2. Theo nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [6], các dịch chiết từ thực vật có tác dụng cao hơn khi kết hợp với NaF hay H2O2. Vì vậy, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng ức chế sự sinh axit của vi khuẩn S.mutans 74 của hai dịch
chiết từ lá cây Lấu Ba Vì và cây xoài khi kết hợp với một số các hợp chất bảo vệ răng miệng.
Luận văn thạc sĩ 47 Dịch chiết được sử dụng ở nồng độ có tác dụng mạnh nhất là 15% (v/v) phối hợp với NaF nồng độ cuối cùng 0,25mM (Theo nghiên cứu trước đây của Phan và cộng sự) [15]. Nồng độ này thấp hơn nhiều lần so với nồng độ fluor được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ răng miệng thông thường. Khả năng kết hợp giữa dịch chiết với NaF lên vi khuẩn S. mutans phân lập từ người Việt Nam được đánh giá qua khả năng ức chế sinh sinh axit của chủng vi khuẩn.
Hình 8. Tác dụng của dịch lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với NaF lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74
Sau 90 phút thí nghiệm được trình bày ở hình 8, pH ở mẫu đối chứng giảm xuống còn 4,08. NaF ở nồng độ 0,25mM có tác dụng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn nghiên cứu nhưng ở mức độ thấp, đạt 5,05. Trong khi đó, khi phối hợp dịch chiết cây xoài với NaF, hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của vi khuẩn cao hơn khi sử dụng dịch chiết ở dạng riêng lẻ, giá trị pH ở hai mẫu nghiên cứu (thân và lá xoài kết hợp với NaF) đều đạt trên 7, với cây Lấu Ba Vì đạt 6,75. Điều này chứng tỏ tác dụng của NaF và dịch chiết có tác dụng cộng gộp, làm tăng khả năng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn S. mutans.
Luận văn thạc sĩ 48
3.1.3.2. Kết hợp với H2O2
Trong nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy H2O2 có tác dụng mạnh lên nhiều quá trình sinh lý của vi khuẩn sâu răng, mặt khác H2O2 cũng được sử dụng trong các sản phẩm nước súc miệng, do vậy chúng tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính của các dịch chiết cây thuốc kết hợp với H2O2 với nồng độ cuối cùng trong dịch nuôi cấy là 0,3mM. Kết quả được thể hiện trong hình 9.
Hình 9. Tác dụng của dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với H2O2 lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74
Kết quả trình bày ở hình 9 cho thấy sau 90 phút đối với mẫu đối chứng H2O có pH là 4,09, mẫu bổ sung H2O2 có pH cuối cùng là 4,37. Các mẫu có bổ sung dịch lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì với H2O2 thì giá trị pH cuối cùng của các mẫu thí nghiệm lần lượt là 6,28; 6,49; và 6,58. Như vậy, các mẫu có bổ sung dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì với H2O2 thì hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của tế bào cao hơn so với mẫu chỉ có dịch chiết riêng lẻ.
Luận văn thạc sĩ 49
3.1.4. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch chiết
Biofilm là một dạng mô phỏng của mảng bám răng. Trong đa số các trường hợp, các tế bào trên biofilm thường chống chịu với các chất kháng khuẩn tốt hơn so với tế bào ở dạng huyền dịch. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các biofilm trên giá thể nhựa đã được tạo ra như là mô hình mảng bám răng trong tự nhiên để kiểm tra tác dụng của các dịch chiết thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng trên mảng bám răng.
Tiến hành nhuộm màng biofilm bằng dung dịch tím kết tinh, có thể dễ dàng quan sát được khả năng hình thành biofilm của chủng vi khuẩn khi không có tác dụng của dịch nghiên cứu so với mẫu thí nghiệm có bổ sung dịch chiết thân và lá xoài. Các tế bào trên biofilm sẽ bắt màu tím với thuốc nhuộm, sự bắt màu càng đậm chứng tỏ mật độ tế bào ở biofilm càng nhiều.
(a) (b)
Hình 10. Sự hình thành biofilm của chủng S.mutans 74
(a)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài
(b)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ
sung dịch chiết Lấu Ba Vì
Luận văn thạc sĩ 50
Hình 11. Sự hình thành biofilm cuả chủng S. mutans GS-5
(a)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài
1.Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài
(b)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ
sung dịch chiết Lấu Ba Vì
Quan sát kết quả nhuộm biofilm trên hình 10 và hình 11, bước đầu chúng ta có thể rút ra nhận xét rằng dịch chiết thân xoài, lá xoài và Lấu Ba Vì đã có tác dụng làm giảm khả năng hình thành biofilm của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu thể hiện ở việc ống effendorf có bổ sung dịch chiết có sự bắt màu với thuốc nhuộm ít hơn so với ống đối chứng chỉ bổ sung dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, đây mới chỉ là các kết quả nghiên cứu bước đầu về khả năng tạo thành và ức chế sự tạo thành biofilm của các chủng vi khuẩn gây sâu răng trên giá thể là ống nhựa (ống effendorf).
Để định lượng được mật độ tế bào trong biofilm hình thành, chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ của chúng ở bước sóng 570nm. Giá trị OD570 phản ánh mật độ tế bào tồn tại trong biofilm, thông qua giá trị này chúng ta có thể đánh giá được khả năng hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn cũng như việc ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch chiết nghiên cứu.
Luận văn thạc sĩ 51
(a) (b)
Hình 12. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans
74 của dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b)
Kết quả trên cho chúng ta thấy dịch chiết của các mẫu nghiên cứu đã có tác dụng ức chế sự hình thành biofilm đối với chủng S. mutans 74 thể hiện ở giá trị OD570 giảm so với giá trị OD570 đối chứng (hình 12).
Đối với chủng S. mutans GS-5, kết quả cho thấy sự hình thành biofilm có phần yếu hơn so với chủng S. mutans 74. Tuy nhiên, đối với các mẫu có bổ sung dịch chiết vẫn cho thấy có sự ức chế hình thành biofilm (hình 13).
(a) (b)
Hình 13. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans GS-5 của dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b).
Luận văn thạc sĩ 52
3.2. Phân tích một số hợp chất thực vật thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn từ cây Lấu Ba Vì và cây xoài
Lấu Ba Vì và xoài là hai cây thuốc có hoạt tính mạnh nhất so với những cây thuốc được nghiên cứu. Nhằm mục đích đưa sản phẩm vào nghiên cứu sâu hơn, chúng tôi đã tiến hành các thí nghiệm nhằm phân lập tách chiết, phân tích các hợp chất thực vật thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn.
3.2.1. Tìm hiểu các thành phần có trong lá cây Lấu Ba Vì và cây xoài trong các hệ dung môi khác nhau hệ dung môi khác nhau
Bước đầu nghiên cứu thành phần có trong dịch chiết thực vật, chúng tôi xác định sự có mặt một số hợp chất thực vật thứ cấp phổ biến bằng các thí nghiệm định tính các hợp chất. Chúng tôi chiết mẫu thực vật bằng các dung môi khác nhau. Kết quả thể hiện qua bảng 3 và bảng 4.
Bảng 3. Thành phần một số hợp chất trong lá cây Lấu Ba Vì chiết bằng các dung môi khác nhau
STT Dung môi Tính chất
Kết quả định tính thành phần các hợp chất Flavonoid Alkaloid Cumarin Glycoside NaOH 10% FeCl3 5% Van - Mayer NaOH 10% + HCl đặc Keller - Killian 1 H2O Trung tính - + ++ - + 2 NaOH Bazo - - + - -
3 Axit acetic Axit - - - - ++
4 Toluen Phân cực ít + - - - - 5 Chloroform Phân cực ít + - - - + 6 Aceton Phân cực ít ++ - + + ++ 7 Ethanol Phân cực + + + + ++ 8 Methanol Phân cực - ++ - - +++ 9 Chloroform : methanol Hỗn hợp - ++ - + ++
Luận văn thạc sĩ 53 (3:7)
10 n- hexan Ít phân cực + - - - -
(-): Không phản ứng; (+): Có phản ứng; (++): phản ứng mạnh;
Bảng 4. Thành phần một số hợp chất có trong dịch chiết cây xoài chiết bằng các dung môi khác nhau
STT Dung môi Mẫu
Tính chất dung
môi
Kết quả định tính thành phần các hợp chất Flavonoid Alkaloid Cumarin Glycosie NaOH 10% FeCl3 10% Van- Mayer NaOH 10% + HCl đặc Keller – Killian 1 H2O Thân xoài Trung tính + + + + - Lá xoài + + + + - 2 NaOH Thân xoài Bazơ + + - - - Lá xoài + + - - - 3 Axit acetic Thân xoài Axit - - ++ - ++ Lá xoài - + - + ++ 4 n- Hexan Thân
xoài Khôg phân cực + - + + + Lá xoài + - + + - 5 Chlorofm Thân xoài Phân cực ít ++ ++ + ++ + Lá xoài ++ ++ - ++ + 6 Acetone Thân xoài Phân cực ít ++ ++ + + - Lá xoài + ++ - - - 7 Ethylacetae Thân xoài Phân cực ít + + ++ + + Lá xoài + + ++ + + 8 Ethanol Thân xoài Phân cực +++ +++ + ++ ++ Lá xoài +++ +++ + ++ ++ 9 Methanol Thân xoài Phân cực +++ ++ + + + Lá xoài ++ ++ + + +
Luận văn thạc sĩ 54 10 Chlorofom: Methanol (1:1) Thân xoài Hỗn hợp ++ ++ + +++ ++ Lá xoài ++ ++ + ++ ++ (-): Không phản ứng; (+): Có phản ứng; (++): phản ứng mạnh;
Từ bảng 3 và bảng 4 cho thấy các nhóm hợp chất thứ cấp đều xuất hiện trong lá cây Lấu Ba Vì và thân, lá xoài. Các hợp chất này tan tốt trong dung môi phân cực và phân cực ít, đặc biệt là trong dung môi ethanol, methanol và dung môi hỗn hợp. Như vậy, kết quả này phù hợp với lựa chọn của chúng tôi trong việc chiết các cây thuốc trong ethanol.
Cũng từ kết quả trên cho thấy các thành phần trong dịch chiết lá và thân xoài bằng ethanol chủ yếu thuộc nhóm flavonoid và alkaloid, giống thành phần hợp chất có trong dịch chiết một số loại thực vật đã được công bố trước đây của Nguyễn Quang Huy và cộng sự (dịch chiết từ vỏ sao đen) [11], của Nguyễn Thị Mai Phương và tập thể (dịch chiết vỏ quả măng cụt) [15] là có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây sâu răng.
3.2.2. Phân tách các hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng
Bước tiếp theo, chúng tôi phân tách các hợp chất bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [10] cho thấy hệ dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho khả năng tách chiết các hợp chất thứ cấp trong dịch chiết thực vật là tốt. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn hệ dung môi TEAF với tỷ lệ 5:3:1:1 cho thí nghiệm sắc kí bản mỏng với các dịch chiết.
Bảng 5. Thành phần của lá Lấu Ba Vì phân tích bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi TEAF (5:3:1:1)
STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hệ số di động Rf 0,44 0,49 0,6 0,72 0,74 0,78 0,83 0,89 0,93 0,98
Luận văn thạc sĩ 55 Màu sắc Vàng nhạt vàng Xanh đậm xanh nhạt Vàng chanh đậm Nâu đậm Nâu nhạt Tím đậm Tím đậm Nâu đất
Bảng 6. Một số phân đoạn dịch chiết từ thân và lá xoài trên sắc ký bản mỏng
Lá xoài Thân xoài
Phân đoạn Màu sắc Hệ số di động Rf
Phân đoạn Màu sắc
Hệ số di động Rf
1 Xanh dương nhạt 0,495 1 Vàng chanh 0,36
2 Hồng nhạt 0,52 2 Vàng xanh nhạt 0,46
3 Xanh lá cây vàng 0,53 3 Xanh rêu đậm 0,57
4 Xanh đen nhạt 0,54 4 Vàng nghệ 0,65
5 Xanh rêu đậm 0,57
6 Vàng nghệ 0,62
7 Xanh vàng 0,72
Từ dịch chiết bằng ethanol qua sắc ký bản mỏng với hệ dung môi TEAF (5:3:1:1) chúng tôi nhận thấy lá xoài có 7 phân đoạn (hình 14c), nhiều phân đoạn hơn dịch chiết thân xoài 4 phân đoạn (hình 14b). Trong các băng vạch xuất hiện trong dịch chiết lá và thân xoài băng có hệ số Rf = 0,57 thấy xuất hiện ở cả lá và thân xoài, ký hiệu là M5.
Luận văn thạc sĩ 56
(a) (b) (c)
Hình 14. Ảnh sắc ký bản mỏng từ dịch chiết Lấu Ba Vì (a), thân xoài (b), lá xoài (c).
Từ các phân đoạn sắc ký bản mỏng thu được, chúng tôi tiến hành đánh giá kiểm tra hoạt tính ức chế sự phát triển của các chủng Streptococci từ các phân đoạn tách từ bản sắc ký (hình 14). Các phân đoạn tách từ bản sắc ký lá, vỏ xoài và Lấu Ba Vì đều có tác dụng ức chế sự phát triển của các chủng Streptococci ở các mức độ khác nhau. Trong đó thấy phân đoạn M5 (có hệ số Rf = 0,57) có hoạt tính mạnh nhất ức chế sự phát triển của cả chủng vi khuẩn S. mutans GS-5, cũng như chủng S.
mutans 74 phân lập từ người Việt Nam (hình 15). Tuy nhiên, vì lượng tách chiết