3.1.1. Khả năng ức chế sự sinh axit từ dịch chiết một số cây thuốc
Trong tự nhiên có nhiều loại thực vật có khả năng kháng khuẩn và được sử dụng rộng rãi trong việc điều trị và chữa các loại bệnh, vết thương. Trong nghiên cứu này, những cây thuốc được lựa chọn theo tác giả Đỗ Tất Lợi [11] hoặc theo những kinh nghiệm thực tế, là những cây thuốc có khả năng chống viêm và được ứng dụng để chữa nhiều bệnh, đặc biệt là những bệnh có liên quan đến răng miệng và kháng khuẩn (Bảng 1).
Bảng 1. Kí hiệu một số mẫu thực vật đƣợc sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên cây thuốc Thành phần sử dụng Kí hiệu
1 Duối – Streblus asper Lá DUL
2 Xoan -.Melia azedarach L Lá XOA
3 Húng quế - Ocimum basilicum L. Thân, rễ, lá, hoa HUN
4 Lấu Ba Vì – Psychotria baviensis Lá LAU
5
Lược vàng - Callisi fragrans L.
Lá LVL
6 Thân LVT
7
Xoài - Mangifera indica L.
Thân Tx
8 Lá Lx
Các bài thuốc trong dân gian chủ yếu dùng nguyên liệu thô (lá, hoa, rễ, thân…) nhai, nuốt, hoặc sắc làm nước uống. Hai phương pháp được sử dụng chiết
Luận văn thạc sĩ 41 bằng ethanol (ngâm rượu) hay chiết bằng nước (sắc thuốc) để uống và ngậm là khá phổ biến. Việc khảo sát ảnh hưởng của nước và ethanol lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans đã được thực hiện bởi Nguyễn Quang Huy và cộng sự cho thấy, với nồng độ ethanol trong môi trường dưới 20% không có ảnh hưởng đến sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans và nồng độ thích hợp để nghiên cứu là 10% [10]. Vì
vậy, bước đầu, chúng tôi cũng khảo sát tác dụng của dịch chiết ở nồng độ 10% (v/v).
Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn S. mutans là làm mòn men răng bởi axit được sinh ra trong quá trình phân giải đường. Do vậy, để xác định tác dụng chống sâu răng của các dịch chiết từ thực vật, bước đầu chúng tôi tìm hiểu ảnh hưởng của chúng tới quá trình sinh axit của chủng vi khuẩn S. mutans 74 là chủng được phân lập từ bệnh nhân sâu răng Việt Nam, qua thí nghiệm xác định sự giảm pH của môi trường qua việc sinh axit của tế bào vi khuẩn S. mutans 74 [19, 53].
Bảng 2. So sánh tác dụng của dịch chiết thực vật chiết trong H2O hoặc ethanol lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74 với nồng độ 10% (v/v)
STT Tên dịch chiết
Giá trị pH cuối cùng
Chiết bằng ethanol Chiết bằng nước
1 LVL 5,51 4,80 2 HUN 5,42 4,98 3 LAU 6,12 4,45 4 DUL 5,06 4,87 5 LVT 4,94 4,88 6 XOA 5,08 5,19 7 Lx 5,87 4,45 8 Tx 5,78 5,17
Luận văn thạc sĩ 42 Kết quả bảng 2 cho thấy dịch chiết trong các cây thuốc trong ethanol có tác dụng ức chế sự sinh axit của vi khuẩn mạnh hơn so với mẫu cùng loại được chiết trong nước. Điều này chứng tỏ hoạt chất chính gây ức chế sự sinh axit của vi khuẩn
S. mutans 74 hòa tan tốt trong ethanol, mặt khác dịch chiết ethanol cũng thuận lợi
hơn cho việc tách chiết [10]. Do vậy, chúng tôi lựa chọn ethanol cho các thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các dịch chiết cây thuốc lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74 được trình bày trong hình 4.
Hình 4. Ảnh hƣởng dịch chiết thực vật lên sự sinh axit của vi khuẩn S.mutans
74
Trong môi trường không bổ sung dịch chiết các cây thuốc, pH của huyền dịch tế bào giảm nhanh (mẫu đối chứng trong ethanol và trong nước), trong khi ở các mẫu có bổ sung dịch chiết vào huyền dịch tế bào làm cho sản xuất axit của vi khuẩn S. mutans 74 đã bị ức chế thể hiện qua sự giảm pH chậm lại. Sau 90 phút thí
Luận văn thạc sĩ 43 nghiệm, kết quả cho thấy ở mẫu đối chứng (ĐC), pH cuối cùng đều nằm trong khoảng 4,0 - 4,6 và ít có sự khác biệt giữa mẫu đối chứng nước hay ethanol. Trong khi ở các mẫu có bổ sung dịch chiết thực vật thì pH cuối cùng cao hơn, với giá trị tương ứng là từ 4,9 đến 6,2.
Trong các mẫu dịch chiết thực vật được làm thí nghiệm, dịch chiết cây Lấu Ba Vì (LAU) và cây Xoài (Tx, Lx) thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit tốt nhất. Giá trị pH giảm của hai mẫu này cho thấy dịch chiết từ xoài và Lấu Ba Vì đã làm chậm tốc độ giảm pH của môi trường, giá trị pH cuối cùng sau 90 phút thí nghiệm là đối với dịch chiết thân xoài là 5,78, dịch chiết lá xoài là 5,87 và đối với dịch chiết lá cây Lấu Ba Vì là 6,12. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn dịch chiết lá xoài, thân xoài và dịch chiết cây Lấu Ba Vì để tiếp tục nghiên cứu.
Từ kết quả đó, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu tác dụng ức chế của dịch chiết lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì ở các nồng độ khác nhau để tìm ra nồng độ dịch chiết có tác dụng mạnh nhất.
Luận văn thạc sĩ 44
Hình 5. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch chiết lá xoài, thân xoài và cây Lấu Ba Vì tới sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans
Khi có mặt dịch chiết của lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì khả năng sản xuất axit của vi khuẩn S. mutans giảm xuống rõ rệt. Khi nồng độ dịch chiết tăng từ 0%
đến 20% (v/v), giá trị pH cuối cùng cũng tăng lên. Điều đó chứng tỏ khả năng ức chế sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans cũng tăng lên (Hình 5). Với dịch chiết từ lá xoài giá trị pH tăng từ 5,26 đến 6,25, dịch chiết thân xoài giá trị pH tăng từ 5,15 đến 6,18 còn với dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì tăng từ 4,99 đến 6,33. Tuy nhiên, nhận thấy từ nồng độ 15% đến 20% không có sự khác biệt về tác dụng ức chế sự giảm axit của S. mutans, thậm chí ở nồng độ 15% còn có tác dụng mạnh hơn (đối với cây Lấu Ba Vì ở nồng độ 15% giá trị pH cuối cùng là 6,33, ở nồng độ 20% là 6,05).
3.1.2. Khả năng diệt S. mutans bởi dịch chiết một số thực vật
Nhằm tìm hiểu khả năng giết vi khuẩn S. mutans của hai dịch chiết từ thân
xoài, lá xoài và lá cây Lấu Ba Vì, chúng tôi đã tiến hành xử lý tế bào chủng S. mutans 74 bằng các dịch chiết tại hai giá trị pH bằng 4,0 và 7,0.
3.1.2.1. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 4,0
Thí nghiệm được tiến hành ở pH 4,0, giá trị pH bắt đầu gây mòn men răng. Đây là môi trường mà vi khuẩn S. mutans có khả năng sinh trưởng tốt, trong khi các chủng vi khuẩn khác kém phát triển [23].
Luận văn thạc sĩ 45
Hình 6. Khả năng giết vi khuẩn S.mutans của các dịch chiết tại pH 4,0
Kết quả ở hình 6 cho thấy, với nồng độ 15%, thời gian 90% quần thể tế bào vi khuẩn bị giết chết tương ứng với giá trị logN/No= -1 lần lượt là hơn 13 phút đối với dịch chiết thân xoài và với dịch chiết lá xoài là 19 phút. Đối với dịch chiết từ lá cây Lấu Ba Vì (LAU), 50% quần thể tế bào bị giết sau khoảng 20 phút xử lý. So sánh với các kết quả nghiên cứu này với một số nghiên cứu đã công bố về dịch chiết một số nguồn thực vật khác như từ vỏ quả măng cụt [18], vỏ sao đen và lá sắn thuyền [7, 17] cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết thân xoài và lá xoài là cao hơn.
3.1.2.2. Khả năng giết vi khuẩn Streptococcus mutans ở pH 7,0
Giá trị pH 7,0 là giá trị pH trung tính trong khoang miệng và được chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các dịch chiết. Kết quả cho thấy ở pH 7,0, các dịch chiết cũng có tác dụng diệt vi khuẩn S. mutans. Tuy nhiên, so với khả năng diệt khuẩn ở pH 4,0 thì khả năng giết vi khuẩn ở pH 7,0 thấp hơn với cùng một nồng độ dịch chiết. Thời gian để diệt 50% số lượng tế bào trong quần thể vi khuẩn S. mutans 74
Luận văn thạc sĩ 46 xoài, lá xoài lần lượt là 23 phút và 25 phút thì 90% số lượng tế bào trong quần thể bị tiêu diệt (Hình 7).
So sánh với các kết quả nghiên cứu trước đây của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [10, 11] cho thấy dịch chiết ethanol từ lá xoài, thân xoài và lá cây Lấu Ba Vì đều có khả năng giết S. mutans 74 thấp hơn so với dịch chiết từ cây Sao đen hay sắn thuyền. Tuy nhiên, đây là kết quả nghiên cứu trên đối tượng là vi khuẩn S. mutans 74, chủng vi khuẩn được phân lập từ người Việt Nam.
Hình 7. Khả năng giết vi khuẩn S. mutans 74 của các dịch chiết tại pH 7,0
3.1.3. Khả năng kết hợp dịch chiết với một số chất bảo vệ răng miệng thông qua khả năng ức chế sự sinh axit
Tổ chức Y tế thế giới đã khuyến cáo nên sử dụng fluor để bảo vệ răng miệng. Thông dụng nhất là hợp chất của flour ở dạng muối NaF hay peroxit hydro H2O2. Theo nghiên cứu của Nguyễn Quang Huy và cộng sự [6], các dịch chiết từ thực vật có tác dụng cao hơn khi kết hợp với NaF hay H2O2. Vì vậy, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát khả năng ức chế sự sinh axit của vi khuẩn S.mutans 74 của hai dịch
chiết từ lá cây Lấu Ba Vì và cây xoài khi kết hợp với một số các hợp chất bảo vệ răng miệng.
Luận văn thạc sĩ 47 Dịch chiết được sử dụng ở nồng độ có tác dụng mạnh nhất là 15% (v/v) phối hợp với NaF nồng độ cuối cùng 0,25mM (Theo nghiên cứu trước đây của Phan và cộng sự) [15]. Nồng độ này thấp hơn nhiều lần so với nồng độ fluor được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ răng miệng thông thường. Khả năng kết hợp giữa dịch chiết với NaF lên vi khuẩn S. mutans phân lập từ người Việt Nam được đánh giá qua khả năng ức chế sinh sinh axit của chủng vi khuẩn.
Hình 8. Tác dụng của dịch lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với NaF lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74
Sau 90 phút thí nghiệm được trình bày ở hình 8, pH ở mẫu đối chứng giảm xuống còn 4,08. NaF ở nồng độ 0,25mM có tác dụng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn nghiên cứu nhưng ở mức độ thấp, đạt 5,05. Trong khi đó, khi phối hợp dịch chiết cây xoài với NaF, hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của vi khuẩn cao hơn khi sử dụng dịch chiết ở dạng riêng lẻ, giá trị pH ở hai mẫu nghiên cứu (thân và lá xoài kết hợp với NaF) đều đạt trên 7, với cây Lấu Ba Vì đạt 6,75. Điều này chứng tỏ tác dụng của NaF và dịch chiết có tác dụng cộng gộp, làm tăng khả năng ức chế sự sinh axit của chủng vi khuẩn S. mutans.
Luận văn thạc sĩ 48
3.1.3.2. Kết hợp với H2O2
Trong nhiều nghiên cứu trước đây cho thấy H2O2 có tác dụng mạnh lên nhiều quá trình sinh lý của vi khuẩn sâu răng, mặt khác H2O2 cũng được sử dụng trong các sản phẩm nước súc miệng, do vậy chúng tôi tiến hành thử nghiệm hoạt tính của các dịch chiết cây thuốc kết hợp với H2O2 với nồng độ cuối cùng trong dịch nuôi cấy là 0,3mM. Kết quả được thể hiện trong hình 9.
Hình 9. Tác dụng của dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì phối hợp với H2O2 lên sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans 74
Kết quả trình bày ở hình 9 cho thấy sau 90 phút đối với mẫu đối chứng H2O có pH là 4,09, mẫu bổ sung H2O2 có pH cuối cùng là 4,37. Các mẫu có bổ sung dịch lá xoài, thân xoài và Lấu Ba Vì với H2O2 thì giá trị pH cuối cùng của các mẫu thí nghiệm lần lượt là 6,28; 6,49; và 6,58. Như vậy, các mẫu có bổ sung dịch chiết cây xoài và Lấu Ba Vì với H2O2 thì hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của tế bào cao hơn so với mẫu chỉ có dịch chiết riêng lẻ.
Luận văn thạc sĩ 49
3.1.4. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch chiết
Biofilm là một dạng mô phỏng của mảng bám răng. Trong đa số các trường hợp, các tế bào trên biofilm thường chống chịu với các chất kháng khuẩn tốt hơn so với tế bào ở dạng huyền dịch. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các biofilm trên giá thể nhựa đã được tạo ra như là mô hình mảng bám răng trong tự nhiên để kiểm tra tác dụng của các dịch chiết thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng trên mảng bám răng.
Tiến hành nhuộm màng biofilm bằng dung dịch tím kết tinh, có thể dễ dàng quan sát được khả năng hình thành biofilm của chủng vi khuẩn khi không có tác dụng của dịch nghiên cứu so với mẫu thí nghiệm có bổ sung dịch chiết thân và lá xoài. Các tế bào trên biofilm sẽ bắt màu tím với thuốc nhuộm, sự bắt màu càng đậm chứng tỏ mật độ tế bào ở biofilm càng nhiều.
(a) (b)
Hình 10. Sự hình thành biofilm của chủng S.mutans 74
(a)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài
(b)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ
sung dịch chiết Lấu Ba Vì
Luận văn thạc sĩ 50
Hình 11. Sự hình thành biofilm cuả chủng S. mutans GS-5
(a)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây xoài
1.Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết thân xoài; 4. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ sung dịch chiết lá xoài
(b)Sự ức chế hình thành biofilm của dịch chiết cây Lấu Ba Vì
1. Đối chứng môi trường; 2. Dịch nuôi cấy vi khuẩn; 3. Dịch nuôi cấy vi khuẩn có bổ
sung dịch chiết Lấu Ba Vì
Quan sát kết quả nhuộm biofilm trên hình 10 và hình 11, bước đầu chúng ta có thể rút ra nhận xét rằng dịch chiết thân xoài, lá xoài và Lấu Ba Vì đã có tác dụng làm giảm khả năng hình thành biofilm của hai chủng vi khuẩn nghiên cứu thể hiện ở việc ống effendorf có bổ sung dịch chiết có sự bắt màu với thuốc nhuộm ít hơn so với ống đối chứng chỉ bổ sung dịch nuôi cấy tế bào vi khuẩn. Tuy nhiên, đây mới chỉ là các kết quả nghiên cứu bước đầu về khả năng tạo thành và ức chế sự tạo thành biofilm của các chủng vi khuẩn gây sâu răng trên giá thể là ống nhựa (ống effendorf).
Để định lượng được mật độ tế bào trong biofilm hình thành, chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ của chúng ở bước sóng 570nm. Giá trị OD570 phản ánh mật độ tế bào tồn tại trong biofilm, thông qua giá trị này chúng ta có thể đánh giá được khả năng hình thành biofilm của các chủng vi khuẩn cũng như việc ức chế sự hình thành biofilm từ các dịch chiết nghiên cứu.
Luận văn thạc sĩ 51
(a) (b)
Hình 12. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans
74 của dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b)
Kết quả trên cho chúng ta thấy dịch chiết của các mẫu nghiên cứu đã có tác dụng ức chế sự hình thành biofilm đối với chủng S. mutans 74 thể hiện ở giá trị OD570 giảm so với giá trị OD570 đối chứng (hình 12).
Đối với chủng S. mutans GS-5, kết quả cho thấy sự hình thành biofilm có phần yếu hơn so với chủng S. mutans 74. Tuy nhiên, đối với các mẫu có bổ sung dịch chiết vẫn cho thấy có sự ức chế hình thành biofilm (hình 13).
(a) (b)
Hình 13. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm của chủng S. mutans GS-5 của dịch chiết thân và lá xoài (a) và Lấu Ba Vì (b).
Luận văn thạc sĩ 52
3.2. Phân tích một số hợp chất thực vật thứ cấp có hoạt tính kháng khuẩn từ cây Lấu Ba Vì và cây xoài
Lấu Ba Vì và xoài là hai cây thuốc có hoạt tính mạnh nhất so với những cây