gây bệnh sâu răng
2.2.9.1. Chuẩn bị tế bào thấm
Tế bào được nuôi qua đêm được rửa 1 lần bằng dung dịch muối khoáng 1x (50mM KCl, 1mM MgCl2) và được hòa lại trong đệm Tris– HCl 50mM, pH 7,5 có bổ sung 1mM MgCl2, 50mM KCl sao cho mật độ tế bào tương đương OD700 = 14. Dung dịch tế bào này được chia đều vào các ống falcon (5ml/ống), bổ sung thêm 10% toluen, trộn mạnh bằng máy Vortex. Sau đó, hỗn hợp được ủ ở 37oC bằng bể ổn nhiệt trong 5 phút rồi chuyển sang làm đông đá bằng nitơ lỏng trong 1 phút. Lặp lại pha làm ấm và đông đá tế bào 2 lần. Cuối cùng, dung dịch tế bào được ủ ở 37oC cho tới khi tan đá hoàn toàn. Loại bỏ toluen dư bằng ly tâm và rửa lại 2 lần với dung dịch muối khoáng 1x. Hòa kết tủa tế bào trở lại trong đệm Tris– HCl pH 7,5 với thể tích bằng 1/10 thể tích ban đầu.
Việc xử lý tế bào với toluen kết hợp với việc chuyển tế bào qua các pha ấm và pha đông đá có tác dụng làm tổn thương cục bộ màng tế bào, làm cho tế bào có thể thấm được các chất có khối lượng phân tử lớn hơn nhưng không làm tổn thương các enzym trên màng. Vì vậy, dịch tế bào được chuẩn bị theo phương pháp này gọi là dịch tế bào thấm, được sử dụng trong các thiết bị thí nghiệm với enzym.
2.2.9.2. Xác định hoạt độ enzym ATPase
Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp của Sturr và Marquis [55].
Nguyên tắc: ATPase xúc tác cho phản ứng thủy phân ATP tạo ra ADP và photphat vô cơ.
ATP ADP + Pi
Hoạt độ enzym ATPase được xác định thông qua việc đo lượng phosphat vô cơ được giải phóng ra. Định lượng photphat bằng phản ứng với thuốc thử Bencini.
Hóa chất: Tris- HCl 100mM, pH 7; MgCl2 10mM; Dịch tế bào thấm; ATP 5mM; TCA 5% (axit tricloaxetic); Thuốc thử Bencini (ZnCl2 100mM, ammonium molibdat ((NH4)2MoO4) 15mM)
Luận văn thạc sĩ 37 Thành phần hỗn hợp phản ứng gồm: a) 500µl Tris- HCl 100mM, MgCl2 10mM, pH 7 b) 100µl dịch tế bào thấm c) 200µl H2O d) 100 µl ATP 5mM e) 100µl TCA f) 100µl dịch chiết Tiến hành: 2 ống nghiệm
Ống đối chứng: hỗn hợp các dung dịch a, b, c, e được trộn đều để TCA làm bất hoạt enzym ATPase sau đó bổ sung d vào lắc đều. Hỗn hợp phản ứng được đem ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 2 phút, thu dịch trong (g).
Ống thí nghiệm: hỗn hợp các dung dịch a, b, c được trộn đều và ủ trong 10phút, tiếp tục bổ sung dung dịch d ủ trong 25 phút ở 25oC. Sau đó thêm e để bất hoạt enzym và ngừng phản ứng. Hỗn hợp phản ứng được đem ly tâm ở 10000 vòng /phút trong 2 phút, thu dịch trong (g).
Định lượng phosphat vô cơ tạo thành, cho vào mỗi ống: 150µl dịch (g) và 900µl thuốc thử Bencini + 150µl H2O.
Hỗn hợp được lắc đều, ủ trong 5 phút và đo độ hấp thụ ở bước sóng 350nm. Hiệu số giữa độ hấp thụ của ống nghiệm và ống đối chứng phản ánh lượng phosphat vô cơ tạo thành.
Một đơn vị hoạt độ enzym ATPase là lượng enzym cần thiết xúc tác cho phản ứng thủy phân ATP để tạo thành 1 µmol phosphat vô cơ trong 1 phút ở điều kiện phản ứng.
2.2.9.3. Xác định hoạt độ NADH oxidase
Hoạt độ của NADH oxidase được xác định theo phương pháp của Poole và Claiborne [52].
Nguyên tắc: Phản ứng dựa trên sự oxi hóa NADH bởi NADH oxidase. Hỗn hợp phản ứng bao gồm:
Luận văn thạc sĩ 38 a) 500µl đệm phosphate 200mM, EDTA 1,2mM (pH 7) b) 100µl β- NADH 2mM c) 200µl H2O2 600mM d) 200µl tế bào thấm e) 200µl dịch chiết Tiến hành
Ống đối chứng: hỗn hợp a, b, d được trộn đều và ly tâm ở 4oC, 10000vòng/phút trong 2 phút, thu dịch trong sau đó bổ sung dung dịch c.
Ống thí nghiệm: hỗn hợp a, b, d, e được trộn đều, ủ trong 10phút, sau đó bổ sung c và trộn đều ngay.
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 340nm trong vòng 3 phút. Hiệu số độ hấp thụ giữa ống kiểm tra và ống thí nghiệm phản ánh lượng NADH đã phản ứng.
Mỗi đơn vị hoạt độ của NADH oxidase là lượng enzym xúc tác cho phản ứng chuyển hóa 1µmol H2O2 thành 1 µmol H2O tương đương với 1 µmol NADH bị oxy hóa thành NAD+ trong 1 phút ở điều kiện phản ứng.
Trong các phân tích ảnh hưởng của dịch chiết, mức độ ảnh hưởng của dịch chiết được đánh giá bằng việc so sánh hoạt độ enzym còn lại khi có dịch chiết so với hoạt độ enzym khi không có dịch chiết.
2.2.9.4. Phân tích hoạt độ enzyme phosphoryl hóa đường (PTS)
Hoạt độ của hệ thống enzyme phosphoryl hóa đường (PTS) được xác định theo phương pháp của Belli và Marquis [25]. Enzyme PTS xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa glucose thành glucose- 6-phosphat được lấy từ phosphoenolpyruvat (PEP). Sau khi mất gốc phosphate, PEP sẽ chuyển thành pyuvat. Hoạt độ enzyme được xác định dựa trên sản phẩm là pyruvat. Pyruvat được xác định bằng phản ứng với NADH do enzyme lactate dehydrogenase (LDH) xúc tác.
Hỗn hợp phản ứng gồm Tris- HCl 50mM, MgCl2 20mM, NaF 1mM, và glucose 40mM, dung dịch tế bào thấm, PEP 5mM, ethanol (ống đối chứng) hoặc ethanol và dịch chiết (ống thí nghiệm). Đối với ống đối chứng, hỗn hợp được ly tâm 10000 vòng/phút trong 2 phút để làm lắng tế bào, không cho enzyme tiếp xúc với
Luận văn thạc sĩ 39 cơ chất trước khi bổ sung PEP. Đối với ống thí nghiệm, dịch chiết được ủ với hỗn hợp trong vòng 10 phút trước khi bổ sung cơ chất, sau khi bổ sung PEP hỗn hợp được ủ ở 370C trong 20 phút, sau đó ly tâm để dừng phản ứng. Dịch trong trên tủa được thu lại để định lượng pyruvat.
Để định lượng pyruvat, cho vào mỗi ống 300 µl dịch trong trên tủa. 400 µl dung dịch β- NADH, 300 µl H2O và bổ sung 2µl LDH. Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút sau đó đem đo hấp thụ ở A340. Hiệu số độ hấp thụ giữa ống đối chứng và ống thí nghiệm phản ánh lượng NADH đã phản ứng với lượng pyruvat tạo thành.
Một đơn vị hoạt độ của enzyme phosphoryl hóa đường là lượng enzyme xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa 1umol glucose thành 1µmol glucose- 6- phosphate, tương đương với 1µmol NADH bị oxi hóa thành NAD+ trong phản ứng chuyển hóa pyruvat thành lactate trong 1 phút ở điều kiện phản ứng.