Sự biểu lộ TNFα bởi tế bào lympho nuôi cấy in vitro xuất hiện từ rất sớm.
Trong thử nghiệm này, tế bào và dịch nổi đƣợc thu hoạch ở thời điểm 4 giờ. Liều lƣợng thuốc và chứng dƣơng và điều kiện nuôi cấy hoàn toàn giống với IL-2. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR đối với biểu lộ mARN ở lympho bào ngƣời thƣờng đƣợc chỉ ra trong Hình 3.5. Các băng của B2M là tƣơng đƣơng nhau, chứng tỏ lƣợng cDNA đƣa vào phản ứng là nhƣ nhau. Sự khác biệt rõ rệt là giữa các nồng độ Crilin T với chứng âm và chứng dƣơng. TNFα tăng biểu lộ ở mức độ mARN ở cả hai nồng độ thấp và cao so với nhóm chứng. Nếu so sánh hai nồng độ của Crilin T thì không thấy sự khác biệt trên băng RT-PCR.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho người bình thường nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA
marker -Fermentas).
Khác với IL-2, sự biểu lộ gen của TNFα do nhiều dòng tế bào tiết hơn là IL- 2 (chỉ tiết bởi Th hoạt hóa). Do đó sự tiết của nó xuất hiện rất sớm ở mức độ mARN (4h sau khi nuôi cấy đã tiết cao nhất) [23]. Trong nghiên cứu này, tế bào đƣợc thu hoạch ở 4h cũng cho kết quả tƣơng tự. Tuy nhiên, nghiên cứu về động học biểu lộ ở nhiều thời điểm trong công trình này chƣa đƣợc thực hiện vì số lƣợng tế bào thu đƣợc từ bệnh nhân thấp nên chỉ đủ để làm ở một thời điểm với các thông số đã nêu.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho bệnh nhân ung thư vòm mũi họng nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low
range DNA marker -Fermentas).
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR đối với biểu lộ mARN TNFα ở lympho bào bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng chỉ ra trong Hình 3.6. Các băng của B2M cũng tƣơng đƣơng nhau, trong khi đó ở hai nồng độ Crilin T đều cho biểu lộ nhiều hơn so với nhóm chứng.
Nếu so sánh sự biểu lộ mARN của TNFα ở bệnh nhân và ngƣời thƣờng thì thấy rằng Crilin T làm tăng biểu lộ TNFα ở cả 02 nhóm lympho bào ngƣời bệnh và ngƣời bình thƣờng. Đây là tín hiệu cho thấy rằng thuốc có tác dụng tốt trong việc kích thích miễn dịch. Điều này sẽ đƣợc chứng minh ở mức độ protein.
3.6. So sánh biểu lộ protein của gen IL-2 ở dịch nuôi cấy lympho bào đƣợc xác định bởi ELISA
Trong tế bào, thông tin quy định về một protein nào đó nằm trong nhiễm sắc
thể của nhân tế bào. Thông tin này đƣợc biểu lộ thông qua mARN có thể đƣợc phát hiện nhƣ trên. Để biết sự biểu lộ ở mức độ protein, ngƣời ta dùng các kỹ thuật xác định protein khác nhau nhƣ WB, ELISA, hóa mô miễn dịch…Chúng tôi dùng kỹ thuật ELISA để xác định protein IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào lympho ngƣời, đây là một kỹ thuật có độ nhạy rất cao. Nhƣ vậy cùng một mục đích với xác định sự biểu lộ của gen.
Hình 3.7. So sánh sự biểu lộ IL-2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân (p=0,045).
Trong 9 mẫu nuôi cấy lympho bào của bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng. Hầu hết Levamisol có tác dụng tăng tiết IL-2, tuy nhiên vẫn chƣa cao hơn nhiều so với nhóm chứng âm (Hình 3.7). Kết quả này cũng phù hợp với kết quả RT-PCR ở trên. Điều này cho thấy sự biểu lộ ở hai mức độ mARN và protein là đồng biến. Sự
Hình 3.8. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở tế bào bệnh nhân in vitro (p= 0,14)
Hình 3.9. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy in vitro tế bào lympho từ bệnh nhân (p=0,39)
Hình 3.10. So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro (p=0,23)
Khi so sánh sự biểu lộ IL-2 ở lympho bào bệnh nhân với các nồng độ Crilin T với levamisol, cho thấy 6/9 mẫu liều thấp và 7/9 (77.7%) mẫu liều cao có sự biểu lộ cao hơn so với Levamisol (Hình 3.8 và hình 3.9). Với tỷ lệ này, chứng tỏ Crilin T có tác dụng kích thích miễn dịch cao hơn Levamisol. Khi xem xét các liều thuốc Crilin T khác nhau, liều thấp cho đáp ứng khá hơn so với liều cao (Hình 3.10). Tuy nhiên, những sự khác biệt này đều không có ý nghĩa thống kê, do cỡ mẫu còn thấp. Các kết quả này cũng phù hợp với sự biểu lộ mARN phát hiện bằng RT-PCR.
Vì đối tƣợng nghiên cứu là máu của những bệnh nhân ung thƣ vòm họng giai đoạn muộn hay ngƣời bình thƣờng đã khác nhau về di truyền học, do đó khả năng đáp ứng của các tế bào lympho nuôi cấy với các tác nhân sinh học có thể khác nhau, sẽ cho kết quả khác nhau. Tuy vậy tỷ lệ đáp ứng trong số mẫu nghiên cứu là khá cao khi kích thích bởi Crilin T.
Đối với đối tƣợng ngƣời thƣờng, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Nhóm chứng có biểu lộ tốt, Levamisol cao hơn chứng âm (Hình 3.11), liều thấp và cao kích thích cao hơn Levamisol (4/5) (Hình 3.12 và hình 3.13) và liều cao lại cho biểu lộ cao
Hình 3.11. So sánh sự biểu lộ Il-2 của lympho được kích thích bởi Levamisol với chứng âm ở người thường (p=0,18).
Hình 3.12. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,25mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,42)
Hình 3.13. So sánh nồng độ IL-2 chứng dương và 0,5mg Crilin T ở dịch nuôi cấy người thường in vitro (p=0,30)
Hình 3.14. So sánh nồng độ IL-2 với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình thường in vitro (p = 0,34)
Để xem xét tổng hợp sự biểu lộ của IL2 giữa nhóm ngƣời thƣờng và nhóm ngƣời bệnh, chúng tôi thấy sự biểu lộ ở nhóm ngƣời bệnh tốt hơn nhóm ngƣời thƣờng (Hình 3.15). Điều này cũng có thể phù hợp với sinh học khi đáp ứng miễn dịch bình thƣờng đã tốt nay kích thích miễn dịch, khả năng tăng đáp ứng sẽ thấp hơn trong tình trạng hệ miễn dịch đã suy yếu khi đƣợc kích thích sẽ có đáp ứng tốt hơn nhƣ ở bệnh nhân ung thƣ. Nhận xét này cũng đã đƣợc chứng minh bởi nhiều tác giả khác trƣớc đây khi dùng các chất kích thích miễn dịch khác [4], [5].
Hình 3.15. So sánh nồng độ IL-2 ở tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng và người bình thường in vitro
3.7. So sánh biểu lộ protein của gen TNFα ở dịch nuôi cấy có sử dụng các thuốc thử
Khác với IL-2, TNFα biểu lộ rất cao trong các tế bào nuôi cấy in vitro, dù
mới chỉ có 4h sau khi nuôi cấy. Và thuốc Crilin T có tác dụng cao hơn các nhóm chứng rất nhiều. Trong hai liều sử dụng thì liều cao thấy tốt hơn (Hình 3.16 và hình 3.17). Khi so sánh giữa bệnh nhân và ngƣời thƣờng cũng cho thấy bệnh nhân đáp ứng tốt hơn. Sự biểu lộ cao của TNFα do có thể có nhiều tế bào tiết ra, không giống
Hình 3.16. So sánh nồng độ TNFα ở liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào lympho in vitro (p=0,17)
Hình 3.17. So sánh nồng độ TNFα với liều Crilin T 0,25mg và 0,5mg ở tế bào người bình thường in vitro (p=0,42)
(A) (B)
Hình 3.18. So sánh sự biểu lộ TNFα ở hai mức độ mARN và Protein ở tế bào lympho của cùng một người bình thường
Sự biểu lộ TNFα ở mức độ mARN không có sự khác biệt giữa các nhóm chứng âm và dƣơng. Sự biểu lộ này thấp hơn so với sự kích thích của Crilin T ở cả hai nồng độ 0,25mg và 0,5mg. Ở mức độ protein cũng cho kết quả tƣơng tự (Hình 3.18A và hình 3.18B). Nhƣ vậy, các kỹ thuật ELISA và RT-PCR đều cho kết quả tốt đối với sự biểu lộ TNFα.
3.8. Đánh giá tác dụng tăng cƣờng miễn dịch của Crilin T so với nhóm chứng dƣơng Levamisol. dƣơng Levamisol.
IL-2 và TNFα là hai cytokin đƣợc nghiên cứu nhiều nhất với mục đích của liệu pháp điều trị miễn dịch. IL-2 có chức năng kích thích sự phân chia của tế bào lympho T gây độc, lympho T giúp đỡ, tế bào diệt tự nhiên và đại thực bào. Tất cả
một peptid, có vai trò rất quan trọng trong cơ chế bảo vệ cơ thể. Nó có thể làm tăng chức năng của tế bào mônô và đại thực bào để gây độc cho tế bào ung thƣ, và gây ra biểu lộ nhiều chất trung gian chống viêm và điều hòa miễn dịch. Theo Gan và cs 2003 việc tiết TNFα sớm hơn nhƣng không kéo dài nhƣ tiết IL-2 khi dùng chất kích thích miễn dịch từ thực vật [23]. Kết quả của chúng tôi cũng tƣơng tự ở một vài mẫu trong một số thời điểm nghiên cứu. Tuy nhiên, số mẫu còn quá thấp, và thời điểm còn quá ít nên việc theo dõi động học trong công trình này chƣa thể có kết luận thống kê.
Qua kết quả thu đƣợc ở cả hai sự biểu lộ IL-2 và TNFα trong các thực nghiệm trên, ta thấy Crilin T có tác dụng mạnh hơn Levamisol, đặc biệt là TNFα có sự chế tiết cao và sớm hơn nhiều so với Levamisol. Kết quả này cũng phù hợp với các tác giả nghiên cứu về chế phẩm Crila ở trong nƣớc và quốc tế về tác dụng tăng cƣờng miễn dịch [19], [26], [40]. Levamisol là chất tổng hợp nên cũng có nhiều tác dụng phụ nặng đã biết khá rõ khi sử dụng trên lâm sàng, trong khi đó, Chế phẩm Crilin T đƣợc chiết từ dƣợc thảo và có nhiều tác dụng tăng cƣờng miễn dịch. Có thể hỗ trợ cho điều trị 1 số bệnh ung thƣ. Việc nghiên cứu một cách có hệ thống hơn với số mẫu lơn hơn có thể giúp đánh giá toàn diện và tìm hiểu cơ chế tác dụng của thuốc vào chính các tế bào đích ung thƣ là cần thiết.
KẾT LUẬN
Từ kết quả mô hình thực nghiệm nuôi cấy tế bào suy giảm miễn dịch ở bệnh nhân UTVMH giai đoạn muộn và ngƣời bình thƣờng về lâm sàng chúng tôi rút ra những kết luận sau:
- Sự biểu lộ IL-2 ở mẫu nuôi cấy tế bào lympho khi có mặt Crilin T ở nhóm
ngƣời ung thƣ vòm họng cao hơn nhóm ngƣời bình thƣờng, và liều thấp Crilin T cho kết quả tốt hơn.
- TNFα ở mẫu nuôi cấy tế bào lympho nhóm ngƣời ung thƣ vòm họng cao hơn
nhóm ngƣời bình thƣờng, và liều cao của Crilin T cho kết quả tốt hơn. Đáp
ứng TNFα xảy ra rất sớm, sau 4h nuôi cấy tế bào lympho in vitro với Crilin T.
- Crilin T có xu hƣớng đáp ứng tốt hơn so với Levamisol ở cả hai cytokin IL-2
KIẾN NGHỊ
- Cần phải tăng số mẫu nghiên cứu để có thể đánh giá chính xác
- Thử tác dụng thuốc ở liều lƣợng khác nhau hơn
- Xây dựng mô hình thực nghiệm ung thƣ do hóa chất để thử tác dụng miễn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Vũ Triệu An, Jean Claude Homberg, (1997), Miễn dịch học. NXB Y học,
1997.
2. Trần Ngọc Anh, Phan Thu Giang, và Trần Văn Quy (2006), Nghiên cứu định
tính, định lượng crinamidin trong dược liệu và viên nang trinh nữ hoàng
cung bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, Kiểm nghiệm thuốc,
4(14), tr. 10-14.
3. Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Hoài Nga, Trần Hồng Trƣờng và cs (2000),
“Tình hình bệnh ung thƣ ở Hà nội giai đoạn 1996-1999”.Tạp chí Y học thực
hành chuyên đề ung thư học, Số 431, tr. 4-7.
4. Đỗ Hòa Bình (2003), Một số thay đổi về số lượng và chức năng của tế bào
lympho và tần suất biểu lộ Protein LMP1, P53, MDM2 ở bệnh nhân ung thư
vòm họng. Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
5. Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Phan Thu Anh và cs (1993), “Nghiên cứu
tình trạng suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào ở bệnh nhân ung thƣ vòm họng
trƣớc điều trị”,Tạp chí Y học Việt Nam, số 9, tr. 1-5.
6. Đỗ Hòa Bình, Phan Thị Phi Phi, Bạch Khánh Hòa và cs (2001), “Sự thay đổi
nồng độ IL2 và IL-10 trong nƣớc nổi nuôi cấy lympho bào máu ngoại vi
bệnh nhân UTVH”.Tuyển tập công trình NCKH của NCS,Tập 5, tr. 2-5.
7. Trần Ngọc Dung (2000), Nghiên cứu các thông số miễn dịch - sinh học giúp
tiên lượng, phát hiện sớm tái phát UTVH và kết hợp viên M sau xạ trị nhằm
giảm tái phát, Luận án tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội.
8. Nguyễn Nam Hải, Nguyễn Tiến Vững (2006), “Phân lập và xác định cấu trúc
9. Võ Thị Bách Huệ, N.K.Q.C., Ngô Văn Thu, Delome Frederic, Daniel F. Michel Becchi (1999), “Khảo sát alcaloid chiết từ lá cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) bằng kỹ thuật sắc ký ghép với
khối phổ (GC - MS)”,Tạp chí Dược học.
10. Nguyễn Ngọc Lanh, Văn Đình Hoa và cs (2006), Miễn dịch học, Nhà xuất
bản y học.
11. Nguyễn Ngọc Lanh, Vũ Triệu An, Phan Thị Phi Phi, Văn Đình Hoa, Phan
Thị Thu Anh, Trần Thị Chính, Dƣơng Ngọc Quý (2003), Miễn dịch học.
Xuất bản lần II. Nhà xuất bản Y học.
12. Đỗ Tất Lợi (2003), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học Hà
Nội, tr. 511-512.
13. Phan Thị Phi Phi (1997), “Đại cƣơng về Cytokin”, Giáo trình giảng dạy sau
đại học.
14. Nguyễn Nhật Thành, Phạm Thị Ninh, Trần Thị Phƣơng Thảo, Hoàng Minh
Châu, Trần Văn Sung (2011), “Nghiên cứu thành phần hóa học lá cây trinh
nữ hoàng cung (Crinum latifolium) trồng ở Đồng Nai, Việt Nam”, Tạp chí
Hóa Học, Số 49 (6A), tr.355-361.
15. Nguyễn Thị Ngọc Trâm (2009), Nghiên cứu khả năng kích thích hệ miễn
dịch chống ung thư của các alkaloid va Flavonoid được chiết xuất từ cây trinh nữ hoàng cung (crinum latifonium L.) để sử dụng làm nguyên liệu sản xuất thuốc bổ trợ điều trị ung thư. Báo cáo tổng hợp kết quả khoa học công nghệ nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa học và công nghệ theo nghị định thư
giữa Việt nam và Bungari, Bộ khoa học và công nghệ.
16. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Trần Công Khánh (2012), “Trinh nữ CRILA-
Crinum latifolium L var. crilae Tram & Khanh, var n.: Một thứ mới của loài Trinh nữ Hoàng cung-Crinum latofolium L. (Họ náng -Amaryllidaceae) ở
17. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Z.K., V. Bankova, S. Popov, E. Zvetkova, E. Katzarovo, Lê Văn Hƣơng (2001), “Hoạt tính gây độc tế bào của phân đoạn
alkaloid từ cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.,Amaryllidaceae)”.
Tạp chí Dược học, số 11, tr. 21-23.
18. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Bảo Lộc (2001), “Khảo sát về thực vật, nuôi trồng
và thu hái cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L)”. Tạp chí Dược
học, Số 2, tr. 21-22.
19. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Phan Thị Phi Phi., Phan Thị Thu Anh và cs (2008),
“Tác dụng phục hồi tổn thƣơng tế bào lympho T và dòng tủy của viên nang
Crila Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)”, Tạp chí Dược học, Số 5,
tr. 12-14.
20. Cao Hữu Vinh (2009), Nghiên cứu nồng độ TNFα ở bệnh nhân nhồi máu não
giai đoạn cấp, Luận văn Y học, tr. 40-60.
Tiếng Anh
21. Chuchawankul, S., N. Khorana, and Y. Poovorawan (2012), “Piperine
inhibits cytokine production by human peripheral blood mononuclear cells”.
Genet Mol Res, 11(1), pp. 617-27.
22. Dong, H., et al. (2010), “Selective effects of Lactobacillus casei Shirota on T
cell activation, natural killer cell activity and cytokine production”, Clin Exp
Immunol, 161(2), pp. 378-88.
23. Gan, L., et al. (2003), “A polysaccharide-protein complex from Lycium
barbarum upregulates cytokine expression in human peripheral blood
mononuclear cells”Eur J Pharmacol, 471(3), pp. 217-22.
24. Geng, X., et al.(2012), “Interleukin-2 and autoimmune disease occurrence
and therapy”,Eur Rev Med Pharmacol Sci, 16(11), pp. 1462-7.
26. Ghosal Sh., S.K.S.a.R.S. (1985), “Crinum alkaloids: their chemistry and
biology.” Phytochemistry, 24, pp. 2141-2156.
27. Ghosal Sh., S.K.S.a.A.V.K. (1984), “1,2-beta-Epoxyambelline, an immuno-
stimulant alkaloid from Crinum latifolium”, J. Chem. Research (S), pp. 232-233.
28. Henegariu, O., et al. (1997), “Multiplex PCR: critical parameters and step-
by-step protocol”, Biotechniques,23(3), pp. 504-11.
29. Hu, L.F., et al. (1991), Isolation and sequencing of the Epstein-Barr virus
BNLF-1 gene (LMP1) from a Chinese nasopharyngeal carcinoma. J Gen