vitro với thuốc thử.
Để đánh giá khả năng miễn dịch của tế bào lympho đối với chế phẩm của
hỗn hợp các phân đoạn alkaloid và flavonoid của cây Trinh nữ Crila (Crilin T), chúng tôi sử dụng mô hình nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi của ngƣời bình thƣờng và bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng. Mô hình này đã đƣợc thực hiện thƣờng quy tại Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh, Đại học Y Hà nội [6]. Việc xác định sự biểu lộ mARN của gen IL-2 nhờ kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi tự thiết kế.
Levamisol, chất tổng hợp có tác dụng tăng cƣờng miễn dịch đã đƣợc dùng trong điều trị lâm sàng, đƣợc sử dụng làm chứng dƣơng cho thực nghiệm nuôi cấy tế bào của công trình này. Chứng âm là các tế bào đƣợc nuôi cấy không cho thuốc thử hoặc chất gì khác ngoài điều kiện nuôi cấy giống các giếng chứng dƣơng và
thử liều chỉ đƣợc thực hiện ở hai nồng độ khác nhau 0.25mg/ml (liều thấp) (giống nồng độ Levamisol) và 0.5mg/ml (liều cao). Ở thời điểm 8 giờ sau khi nuôi cấy sự biểu lộ mARN của IL-2 đƣợc thể hiện trong Hình 3.3.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho người bình thường nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA
marker -Fermentas).
Với vai trò của gen nội chuẩn B2M là không chỉ dùng để đánh giá chất lƣợng của cDNA/mARN chiết tách đƣợc mà còn có chức năng rất quan trọng là xác định lƣợng cDNA đƣa vào phản ứng PCR có tƣơng đƣơng nhau hay không. Dựa vào băng nội chuẩn B2M ta có thể biết đƣợc mức độ biểu lộ xác định đƣợc là tăng hay giảm của các mẫu nghiên cứu. Đối với lympho bào của ngƣời bình thƣờng (Hình 3.3) B2M có kết quả tƣơng đƣơng nhau, ngoại trừ mẫu Crilin T có hàm lƣợng 0,25mg/ml (hơi cao hơn một chút). Nếu so sánh mẫu chứng âm với chứng dƣơng, ta thấy có sự khác biệt về biểu lộ IL-2, thể hiện bởi các băng nhạt (mẫu chứng âm) và băng đậm hơn (mẫu chứng dƣơng). Trong khi đó, khi ta so sánh các mẫu thuốc thử
nồng độ thấp và cao thì thấy ở nồng độ thấp IL2 cho biểu hiện nhiều hơn so với nồng độ cao, mặc dù B2M hơi khác nhau đôi chút ở hai mẫu này.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho nuôi cấy của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp
(low range DNA marker -Fermentas).
Sự biểu lộ IL-2 ở lympho bào của bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng bởi RT- PCR đƣợc thể hiện trong Hình 3.4. Các mẫu nghiên cứu của bệnh nhân đƣợc nuôi cấy cùng điều kiện và song song với các mẫu của ngƣời bình thƣờng với thời gian thu hoạch nhƣ nhau. Kiểu biểu lộ của lympho bào ở bệnh nhân cũng giống nhƣ ngƣời bình thƣờng (Hình 3.3) có nghĩa là chứng dƣơng và chứng âm giống nhau. Biểu lộ IL-2 của liều thấp Crilin T biểu hiện rõ nét so với liều cao, trong khi băng của gen nội chuẩn B2M tƣơng đƣơng nhau.
Nhƣ vậy, cả bệnh nhân và ngƣời thƣờng đều cho kết quả nhƣ nhau và điều đặc biệt là Crilin T cho kết quả kích thích tăng tiết IL-2 cao hơn so với chứng
bằng RT-PCR (Hình 3.3 và Hình 3.4) có khác nhau hay không thì không phải dễ vì hình ảnh có độ phân dải, đậm nhạt khác nhau. Cần phải đối chiếu với kết quả ELISA, sẽ bàn luận sau.