2.3.7. Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào lympho
* Nguyên lý:
Đây là một kỹ thuật miễn dịch đánh dấu enzym dùng để định lƣợng IL-2 và TNFα trong huyết thanh, dịch não tủy, nƣớc tiểu và dịch nuôi cấy tế bào theo nguyên lý Sandwich. Kháng thể đơn dòng đã đƣợc gắn bản, kết hợp với IL-2 hoặc TNFα trong mẫu nuôi cấy đƣợc nhỏ vào giếng. Sau đó cho thêm kháng thể đơn dòng thứ 2 gắn biotin và ủ. Tiếp theo, rửa lần 1 và cho enzyme gắn streptavidin và ủ. Rửa lần 2 và cho cơ chất, nếu trong dịch nổi có IL-2 hoặc TNFα thì nó sẽ gắn kết với KT và đƣợc phát hiện nhờ vào phản ứng sinh mầu với cơ chất TMB. Màu xanh
Cặn tế bào nuôi cấy
Tách ARN
Điện di, đo OD và PCR kiểm tra
PCR đơn/đa mồi cADN
Điện di, nhuộm sản phẩm PCR và chụp ảnh
của cơ chất đƣợc đo ở bƣớc sóng 450 nm, cƣờng độ màu tỷ lệ với IL-2 và TNFα trong nƣớc nổi.
* Các bước tiến hành theo quy trình của Kit ELISA (công ty Invitrogen –Califorlia,
Mỹ) được tóm tắt như sau:
o Kỹ thuật ELISA định lượng IL-2
- Cho 100l dung dịch đệm pha loãng chuẩn (Standard Diluent Buffer) vào
giếng 1 - giếng chứng âm (Zezo)
- Cho 100l dịch nổi vào các giếng còn lại theo thứ tự
- Cho 50l dung dịch đệm ủ vào tất cả các giếng
- Cho 50l Biotin Conjugate vào tất cả các giếng, lắc nhẹ, sau đó ủ 2 giờ
- Rửa 4 lần bằng máy rửa
- Cho 100 l Streptavidin HRP (đã pha) vào tất cả các giếng, tiến hành ủ
30 phút
- Rửa 4 lần, sau đó cho 100l Stabilized Chromogel vào tất cả các giếng, ủ
30 phút
- Bổ sung 100 l dung dịch dừng phản ứng. Tiến hành đo ở bƣớc sóng 450
nm, thể tích 200l.
o Kỹ thuật Elisa định lượng TNF-α
- Cho 100l Standard Diluent Buffer vào giếng 1 - giếng chứng âm (Zezo)
- Cho 50l Standard Diluent Buffer vào tất cả các giếng
- Cho 100l dịch nuôi cấy vào các giếng còn lại theo thứ tự
- Lắc nhẹ, sau đó ủ 2 giờ
- Rửa 4 lần
- Rửa 4 lần, sau đó cho 100l Stabilized Chromogel vào tất cả các giếng, ủ 30 phút
- Bổ sung 100 l dung dịch dừng phản ứng. Tiến hành đo ở bƣớc sóng 450
nm, thể tích 200l.
- Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA xử lý số liệu và lập biểu đồ
(Đường chuẩn được chạy đồng thời với mẫu nghiên cứu ở cả cytokin IL-2 và
TNFα với các chất chuẩn được pha loãng ở năm điểm khác nhau. Nồng độ của mỗi mẫu được xác định dựa vào đường chuẩn bằng phần mềm của máy đọc ELISA (Bio-
Rad, USA). Các số liệu thu được, được xử lý theo phần mềm chuyên dụng).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Có nhiều kit hoặc hóa chất khác nhau đƣợc sử dụng để chiết tách các ARN từ các tế bào máu hoặc nuôi cấy tế bào. Mỗi loại có thể dựa vào các nguyên lý riêng, nhƣng chúng đều cho các kết quả là chất lƣợng ARN tốt, dùng cho các ứng dụng tiếp theo nhƣ các kỹ thuật PCR, microarray, giải trình tự gen,... Trong công trình này chúng tôi chọn phƣơng pháp chiết tách ARN có sử dụng Trizol. Các mẫu
cặn tế bào nuôi cấy đƣợc thu hoạch và bảo quản ở nhiệt độ -800C tại Bộ môn Miễn
dịch-Sinh lý bệnh cho đến khi ARN đƣợc chiết tách.
Để đánh giá chất lƣợng ARN chiết tách đƣợc, ngƣời ta có thể sử dụng các phƣơng pháp gồm: điện đi trong thạch argarose 0.8%, đo OD để tính ra nồng độ và kiểm tra bằng PCR với cặp mồi của gen nội chuẩn. Mặc dù cùng chung một mục đích là đánh giá chất lƣợng, song mỗi phƣơng pháp kiểm tra này có những ƣu điểm và nhƣợc điểm riêng. Hình ảnh điện di cho thấy ARN có trọng lƣợng phân tử của các băng ARNt, trong khi đo mật độ quang học (OD) bằng máy đo quang phổ kế sẽ cho ta biết độ tinh sạch dựa vào tỷ lệ OD260/280 và cho phép tính nồng độ ARN thu đƣợc. Tuy nhiên, do lƣợng tế bào lympho thu đƣợc thấp sau khi tách từ máu toàn phần bởi Ficol, nên mỗi giếng chỉ có 500.000 tế bào. Khi thu hoạch, lƣợng tế bào còn thấp hơn nữa do tế bào chết đi hoặc mất trong quá trình chiết tách, do đó lƣợng ARN thu đƣợc là rất thấp không đo đƣợc OD và không phát hiện tốt bởi điện di. Chúng tôi kiểm tra bằng phản ứng RT-PCR với mồi của gen B2M thì vẫn cho kết quả dƣơng tính với các băng đậm rõ nét (Hình 3.1A). Nhƣ vậy việc xác định sự biểu lộ các gen IL-2 và TNFα bằng phản ứng RT-PCR có độ nhạy cao là khả quan.
3.2. Phản ứng RT-PCR đơn mồi của gen B2M, IL-2 và TNFα
Phản ứng PCR đang đƣợc sử dụng rộng rãi ở rất nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu hay chẩn đoán trên thế giới. Phản ứng này cho phép khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu với các mồi có trình tự mồi đặc hiệu cho gen đó và hỗn hợp các
ADN khuôn mẫu, sử dụng các chu kỳ nhiệt khác nhau, đƣợc đăng tải bởi nhiều công trình nghiên cứu [44]. RT-PCR cũng là một trong các loại của PCR, cho phép xác định sử biểu lộ của gen ở mức độ ARN cũng sẽ tuân theo nhƣng quy luật trên. Tuy nhiên trƣớc hết cần phải chuyển từ mARN sang cDNA bằng một phản ứng với enzym sao chép ngƣợc.
Trình tự cặp mồi B2M đƣợc lấy từ công trình của Nguyễn Văn Đô và cs (2012) [42]. Còn 02 cặp mồi IL-2 và TNFα do chúng tôi tự thiết kế dựa vào phần mềm Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/). Kích thƣớc của các cặp mồi nằm trong khoảng 65-140bp, là những kích thƣớc ngắn có thể dùng cho cả ARN đƣợc chiết tách từ tế bào tƣơi, nhƣng cũng có thể dùng cho ARN từ các lắt cắt tổ chức đã đúc paraffin. Theo kinh nghiệm của chúng tôi, khi sử dụng một cặp mồi mới cho phản ứng PCR, các nồng độ Mg++ khác nhau cần phải thử để tối ƣu hóa phản ứng. Tùy theo độ nhạy của mỗi cặp mồi mà phản ứng sẽ diễn ra theo các điều kiện khác nhau.
Các cặp mồi này đều đƣợc khuếch đại đơn mồi với các tế bào dòng CTLL-2 (IL- 2) và L929 (TNFα), chúng đều đƣợc thử điều kiện tối ƣu và cho kết quả dƣơng tính với 01 băng duy nhất cho mỗi gen nghiên cứu và gen nội chuẩn B2M (Hình 3.1 A, B, C).
Hình 3.1. RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL-2 và TNFα ở các tế bào dòng chuẩn
Chú thích: Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas). A) Biểu lộ gen nội chuẩn B2M ở hai dòng tế bào L929 (mẫu 2) và CTLL-2 (mẫu 3). B) IL-2 biểu lộ ở dòng tế bào (CTLL-2). C) TNFα biểu lộ ở dòng tế bào (L929).
3.3. Phản ứng RT-PCR đa mồi của gen B2M với IL-2/TNFα
Kỹ thuật PCR đa mồi cũng dựa trên nguyên lý của PCR đơn mồi, nhƣng nó có ít nhất từ 02 cặp mồi trở lên đƣợc khuếch đại trong một ống nghiệm PCR. Tuy nhiên, PCR đa mồi cũng có những đặc điểm riêng mà khi chúng ta thực hiện cần phải chú ý từ khâu thiết kế mồi nhƣ nhiệt độ gắn mồi tƣơng tự nhau, kích thƣớc sản phẩm khác nhau, và các thành phần khác của hỗn hợp PCR có thể cũng phải tăng lên [28], [37]. Ngƣời ta có thể khuếch đại một phản ứng với 5-6 cặp mồi với PCR loại thông thƣờng hay methyl hóa với các enzym đặc biệt hơn.
Ngày nay, PCR đa mồi đang đƣợc sử dụng ngày một phổ biến vì kỹ thuật này có nhiều ƣu điểm gồm: tiết kiệm đƣợc thời gian, kinh phí, mẫu nghiên cứu, đặc biệt trong những trƣờng hợp mẫu hiếm hoặc quá nhỏ. Ngoài ra, nó còn hạn chế những nhƣợc điểm khác của PCR nhƣ nhiễm ADN không mong muốn [37].
Trong công trình này, phản ứng PCR đa mồi chỉ có 02 cặp mồi là gen nội chuẩn B2M và IL-2 hoặc TNFα. Để tránh sự khuếch đại nhiều băng không đặc hiệu, ngƣời ta tạo ra các enzym taq polymerase chỉ đồng loạt đƣợc giải phóng để hoạt động khi ở nhiệt độ cao, trong công trình này chúng tôi sử dụng enzym Amplitaq Gold (ABI, USA). Có nghĩa là ở nhiệt độ thƣờng các emzym này không hoạt động. Do đó, các cặp mồi sẽ đƣợc khuếch đại đồng thời và tránh đƣợc sự gắn mồi không đặc hiệu và tạo ra nhiều sản phẩm không mong muốn. Kết quả cho thấy không có băng không đặc hiệu (Hình 3.2 A và 3.2 B).
Hình 3.2. Hình ảnh PCR đa mồi của cặp gen nội chuẩn. (A) Các băng được khuếch đại mARN của gen B2M và IL-2; (B) B2M và TNFα. Marker: 0.5µg ADN
thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas).
Với kết quả này, PCR đa mồi sẽ đƣợc dùng để xác định sự biểu lộ gen IL-2 và TNFα ở các mẫu nuôi cấy lympho bào của ngƣời bình thƣờng và bệnh nhân ung thƣ vòm.
3.4. Sự biểu lộ IL-2 ở mức độ mARN của lympho bào máu ngoại vi nuôi cấy in vitro với thuốc thử. vitro với thuốc thử.
Để đánh giá khả năng miễn dịch của tế bào lympho đối với chế phẩm của
hỗn hợp các phân đoạn alkaloid và flavonoid của cây Trinh nữ Crila (Crilin T), chúng tôi sử dụng mô hình nuôi cấy tế bào lympho máu ngoại vi của ngƣời bình thƣờng và bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng. Mô hình này đã đƣợc thực hiện thƣờng quy tại Bộ môn Miễn dịch-Sinh lý bệnh, Đại học Y Hà nội [6]. Việc xác định sự biểu lộ mARN của gen IL-2 nhờ kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi tự thiết kế.
Levamisol, chất tổng hợp có tác dụng tăng cƣờng miễn dịch đã đƣợc dùng trong điều trị lâm sàng, đƣợc sử dụng làm chứng dƣơng cho thực nghiệm nuôi cấy tế bào của công trình này. Chứng âm là các tế bào đƣợc nuôi cấy không cho thuốc thử hoặc chất gì khác ngoài điều kiện nuôi cấy giống các giếng chứng dƣơng và
thử liều chỉ đƣợc thực hiện ở hai nồng độ khác nhau 0.25mg/ml (liều thấp) (giống nồng độ Levamisol) và 0.5mg/ml (liều cao). Ở thời điểm 8 giờ sau khi nuôi cấy sự biểu lộ mARN của IL-2 đƣợc thể hiện trong Hình 3.3.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho người bình thường nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA
marker -Fermentas).
Với vai trò của gen nội chuẩn B2M là không chỉ dùng để đánh giá chất lƣợng của cDNA/mARN chiết tách đƣợc mà còn có chức năng rất quan trọng là xác định lƣợng cDNA đƣa vào phản ứng PCR có tƣơng đƣơng nhau hay không. Dựa vào băng nội chuẩn B2M ta có thể biết đƣợc mức độ biểu lộ xác định đƣợc là tăng hay giảm của các mẫu nghiên cứu. Đối với lympho bào của ngƣời bình thƣờng (Hình 3.3) B2M có kết quả tƣơng đƣơng nhau, ngoại trừ mẫu Crilin T có hàm lƣợng 0,25mg/ml (hơi cao hơn một chút). Nếu so sánh mẫu chứng âm với chứng dƣơng, ta thấy có sự khác biệt về biểu lộ IL-2, thể hiện bởi các băng nhạt (mẫu chứng âm) và băng đậm hơn (mẫu chứng dƣơng). Trong khi đó, khi ta so sánh các mẫu thuốc thử
nồng độ thấp và cao thì thấy ở nồng độ thấp IL2 cho biểu hiện nhiều hơn so với nồng độ cao, mặc dù B2M hơi khác nhau đôi chút ở hai mẫu này.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của IL-2 ở lympho nuôi cấy của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp
(low range DNA marker -Fermentas).
Sự biểu lộ IL-2 ở lympho bào của bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng bởi RT- PCR đƣợc thể hiện trong Hình 3.4. Các mẫu nghiên cứu của bệnh nhân đƣợc nuôi cấy cùng điều kiện và song song với các mẫu của ngƣời bình thƣờng với thời gian thu hoạch nhƣ nhau. Kiểu biểu lộ của lympho bào ở bệnh nhân cũng giống nhƣ ngƣời bình thƣờng (Hình 3.3) có nghĩa là chứng dƣơng và chứng âm giống nhau. Biểu lộ IL-2 của liều thấp Crilin T biểu hiện rõ nét so với liều cao, trong khi băng của gen nội chuẩn B2M tƣơng đƣơng nhau.
Nhƣ vậy, cả bệnh nhân và ngƣời thƣờng đều cho kết quả nhƣ nhau và điều đặc biệt là Crilin T cho kết quả kích thích tăng tiết IL-2 cao hơn so với chứng
bằng RT-PCR (Hình 3.3 và Hình 3.4) có khác nhau hay không thì không phải dễ vì hình ảnh có độ phân dải, đậm nhạt khác nhau. Cần phải đối chiếu với kết quả ELISA, sẽ bàn luận sau.
3.5. Sự biểu lộ mARN của TNFα ở lympho bào nuôi cấy in vitro với thuốc thử.
Sự biểu lộ TNFα bởi tế bào lympho nuôi cấy in vitro xuất hiện từ rất sớm.
Trong thử nghiệm này, tế bào và dịch nổi đƣợc thu hoạch ở thời điểm 4 giờ. Liều lƣợng thuốc và chứng dƣơng và điều kiện nuôi cấy hoàn toàn giống với IL-2. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR đối với biểu lộ mARN ở lympho bào ngƣời thƣờng đƣợc chỉ ra trong Hình 3.5. Các băng của B2M là tƣơng đƣơng nhau, chứng tỏ lƣợng cDNA đƣa vào phản ứng là nhƣ nhau. Sự khác biệt rõ rệt là giữa các nồng độ Crilin T với chứng âm và chứng dƣơng. TNFα tăng biểu lộ ở mức độ mARN ở cả hai nồng độ thấp và cao so với nhóm chứng. Nếu so sánh hai nồng độ của Crilin T thì không thấy sự khác biệt trên băng RT-PCR.
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho người bình thường nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA
marker -Fermentas).
Khác với IL-2, sự biểu lộ gen của TNFα do nhiều dòng tế bào tiết hơn là IL- 2 (chỉ tiết bởi Th hoạt hóa). Do đó sự tiết của nó xuất hiện rất sớm ở mức độ mARN (4h sau khi nuôi cấy đã tiết cao nhất) [23]. Trong nghiên cứu này, tế bào đƣợc thu hoạch ở 4h cũng cho kết quả tƣơng tự. Tuy nhiên, nghiên cứu về động học biểu lộ ở nhiều thời điểm trong công trình này chƣa đƣợc thực hiện vì số lƣợng tế bào thu đƣợc từ bệnh nhân thấp nên chỉ đủ để làm ở một thời điểm với các thông số đã nêu.
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR của TNFα ở lympho bệnh nhân ung thư vòm mũi họng nuôi cấy. Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low
range DNA marker -Fermentas).
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR đối với biểu lộ mARN TNFα ở lympho bào bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng chỉ ra trong Hình 3.6. Các băng của B2M cũng tƣơng đƣơng nhau, trong khi đó ở hai nồng độ Crilin T đều cho biểu lộ nhiều hơn so với nhóm chứng.
Nếu so sánh sự biểu lộ mARN của TNFα ở bệnh nhân và ngƣời thƣờng thì thấy rằng Crilin T làm tăng biểu lộ TNFα ở cả 02 nhóm lympho bào ngƣời bệnh và ngƣời bình thƣờng. Đây là tín hiệu cho thấy rằng thuốc có tác dụng tốt trong việc kích thích miễn dịch. Điều này sẽ đƣợc chứng minh ở mức độ protein.
3.6. So sánh biểu lộ protein của gen IL-2 ở dịch nuôi cấy lympho bào đƣợc xác định bởi ELISA
Trong tế bào, thông tin quy định về một protein nào đó nằm trong nhiễm sắc
thể của nhân tế bào. Thông tin này đƣợc biểu lộ thông qua mARN có thể đƣợc phát hiện nhƣ trên. Để biết sự biểu lộ ở mức độ protein, ngƣời ta dùng các kỹ thuật xác định protein khác nhau nhƣ WB, ELISA, hóa mô miễn dịch…Chúng tôi dùng kỹ thuật ELISA để xác định protein IL-2 và TNFα trong dịch nuôi cấy tế bào lympho ngƣời, đây là một kỹ thuật có độ nhạy rất cao. Nhƣ vậy cùng một mục đích với xác định sự biểu lộ của gen.
Hình 3.7. So sánh sự biểu lộ IL-2 của Levamisol với chứng âm ở bệnh nhân (p=0,045).
Trong 9 mẫu nuôi cấy lympho bào của bệnh nhân ung thƣ vòm mũi họng. Hầu hết Levamisol có tác dụng tăng tiết IL-2, tuy nhiên vẫn chƣa cao hơn nhiều so