Levamisole (phenyl emido thiazole hay 2,3,5,6 tetrahydro - 6 - phenyllimidazo (2,1) thiazo) là chất kích thích miễn dịch đƣợc phát hiện từ năm 1971 bởi Andricec J.M và cộng sự. Khởi đầu levamisole đƣợc dùng làm thuốc chống giun sán, sau nhận thấy nó có tác dụng làm tăng các lympho bào T và có tác dụng phục hồi cân bằng hoạt động giữa lympho bào T hỗ trợ và lympho bào T ức chế vì vậy đƣợc sử dụng nhƣ chất điều biến miễn dịch [1], [43], [49].
Những nghiên cứu tiếp theo đã cho ngƣời ta thấy rằng phần sunfua trong công thức phân tử của chúng có liên quan tới tác dụng kịch thích miễn dịch. Từ đó là cơ sở để nghiên cứu cải tiến cấu tạo phân tử của các chất bằng tổng hợp hóa học để nâng cao kết quả kích thích miễn dịch. Các biệt dƣợc NPT 16416; ADA 202 - 718 là các thiazol benzimidazole của levamisole đang đƣợc thử nghiệm [45].
cứu đã làm sáng tỏ mọi vấn đề về cơ chế tác dụng, công thức hóa học, cấu trúc phân tử. Vì vậy, Levamisol đƣợc sử dụng trong thực nghiệm nuôi cấy tế bào lympho máu
ngoại vi in vitro của công trình này, với vai trò là chứng dƣơng [47].
1.3.4. Tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư của TNHC
Cây TNHC Crinum latifolium L. đã đƣợc nhân dân sử dụng để điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt và u xơ tử cung, ngoài ra còn đƣợc sự dụng để điều trị bệnh ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, tử cung, dạ dày, phổi và tuyến tiền liệt. Trong những năm qua đã có nhiều công trình khoa học nghiên cứu ở trong và ngoài nƣớc về cây thuốc quý này [14], [17], [27].
Yui và cộng sự đã chứng minh alkaloid lycorin, hoạt chất chính từ cây náng có tên khoa học Crinum latifolium L. có tác dụng kích thích tế bào lympho T trong ống nghiệm và trên sinh vật hoạt động phát triển. Các tác giả Nguyễn Thị Ngọc Trâm, và cộng sự cũng đã chứng minh dịch chiết nƣớc nóng từ lá cây TNHC Việt Nam (Crinum latifolium L.) có thể kích thích hữu hiệu sự sinh sản của tế bào
lympho T và đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp lên các tế bào TCD3, TCD4 in
vitro [40]. Nguyễn Thị Ngọc Trâm, và cộng sự cũng đã tiến hành thử nghiệm gây
ung thƣ trên chuột cống trắng Wistar 50 – 55 ngày tuổi, bằng cách cấy dƣới da chất hóa học gây ung thƣ 20-methylcholantrene và tiến hành thí nghiệm cho uống dịch chiết bằng nƣớc nóng của lá cây TNHC và kéo dài đời sống của súc vật mang u (53 ngày/73 ngày) [15]. Kết quả này cho thấy dịch chiết này đã làm chậm sự tăng trƣởng khối u thực nghiệm. Ở Ấn Độ, tác giả Ghosal khẳng định một số alkaloid từ TNHC nhƣ crinafolin, crinafolidin đã đƣợc thử nghiệm với tế bào ung thƣ và cho kết quả dƣơng tính [26]. Để chứng minh tác dụng của viên Crila, một loại thuốc đƣợc chiết xuất từ lá cây TNHC (đã đƣợc dung trên bệnh nhân u xơ tuyến tiền liệt và u xơ tử cung) có hỗ trợ điều trị ung thƣ (tác dụng tăng cƣờng miễn dịch trên thực nghiệm, khả năng chữa tình trạng suy tủy xƣơng của bệnh phóng xạ cấp, bán cấp và có thể loại bỏ đƣợc tác dụng phụ nặng nề của hóa trị liệu) hay không, Phan Thị Phi Phi và cộng sự trƣờng Đại học Y Hà Nội đã sử dụng mô hình chiếu tia xạ bán cấp
cho chuột nhắt để gây suy giảm dòng tế bào tủy và dòng tế bào lympho và tế bào diệt tự nhiên (NK-natural killers) rồi điều trị với viên Crila, sau đó đánh giá khả năng hồi phục dòng tế bào lympho T, tế bào NK (cả về số lƣợng và chức năng tiết hai cytokin chủ yếu của miễn dịch chống ung thƣ: IL-2 và TNFα), và khả năng hồi phục dòng tế bào tủy của những chuột bị chiếu tia gamma này [19].
Sự giảm sút nặng nề của dòng tủy và dòng lympho xảy ra ở chuột nhắt chiếu tia cấp, bán cấp là các biến đổi đã đƣợc các nhà nghiên cứu y học và thực hành lâm sàng khẳng định. Kết quả thu đƣợc của Phan Thị Phi Phi phù hợp với các tác giả đã đƣợc công bố trƣớc đây. Khi nhận định bằng hình thái học, chủ yếu dựa vào kích thƣớc tế bào thì không phát hiện đƣợc sự thay đổi của bạch cầu ái toan và nhất là bạch cầu diệt tự nhiên NK, nhƣng khi sự nhận dạng đƣợc dựa trên dấu ấn miễn dịch
(kháng nguyên CD16+/56+ của NK) rõ ràng, chính xác thì tia gamma đã làm NK
giảm sút đặc biệt có ý nghĩa, cả trong máu ngoại vi và trong lách, với p đều dƣới 0,001 [17].
Các tế bào NK đƣợc phát hiện vào những năm 1980, khi ngƣời ta thấy máu có khả năng gây độc với virus, với các tế bào máu gốc và tế bào ung thƣ. Dƣới tác dụng của tế bào NK, các tế bào ung thƣ máu, myeloma, carcinoma, sarcoma, melanoma của ngƣời bị dung giải hay ức chế. Các chuột Beige có hoạt tính NK kém, rất nhạy cảm với bệnh ung thƣ máu. NK đƣợc chính thức xem nhƣ một quần thể chống ung thƣ mạnh của miễn dịch bẩm sinh không đặc hiệu vì không cần mẫn cảm trƣớc với kháng nguyên. Chuột chiếu tia, uống viên Crila làm số lƣợng NK khôi phục về trị số sinh học.
Các tế bào TCD4, TCD8 là các quần thể gây độc với virus và với ung thƣ thông
qua 2 cytokin quan trọng nhất là IL-2 và TNF-α hay là trực tiếp gây dung giải tế bào ung thƣ và tế bào nhiễm virus. Liều tia xạ đã sử dụng trong thực nghiệm đã gây giảm có ý nghĩa đặc biệt toàn bộ các nhóm tế bào lympho, đặc biệt là dòng T và
tế bào T chín ở máu ngoại vi, đƣợc giới hạn trong MHC lớp 1, có thể đại diện cho
TCD8 chín và có chức năng.
Tế bào TCD8 (hay chủ yếu là TCD8b) là tế bào gây độc đặc hiệu chính với tế
bào ung thƣ. Ở đây tia gamma không những gây giảm có ý nghĩa số lƣợng tế bào của những quần thể này mà chức năng của chúng cũng giảm mạnh, thể hiện bằng giảm IL-2. Do TNF-α có nhiều nguồn ngốc hơn (đại thực bào, tế bào Mast, tế bào lympho) nên hàm lƣợng nó vẫn duy trì đƣợc.
Khi đƣợc điều trị bằng Crila, các quần thể tế bào lympho CD3, CD4, CD8a và
CD8b, kể cả NK ở máu ngoại vi và ở lách đƣợc hồi phục cả số lƣợng, tỷ lệ % và cả
chức năng chế tiết IL-2 về gần trị số sinh học. IL-2 có tác dụng làm tăng sinh và tăng biệt hóa tế bào lympho T, hoạt hóa Tc (T cytotoxic) và hoạt hóa đại thực bào, có vai trò quan trọng trong miễn dịch chống ung thƣ.
Hàm lƣợng TNF-α đƣợc sản xuất từ nhiều loại tế bào. TNF-α có tác dụng hoạt hóa các đại thực bào, bạch cầu hạt và các tế bào gây độc, tăng cƣờng sự dính của bạch cầu với tế bào nội mạc, gây gầy mòn, sốt, cảm ứng sự tiết protein pha cấp, kích thích sự tạo mạch máu, tăng cƣờng sản xuất các phần tử MHC lớp 1. Tác dụng của TNF-α vì thế có trên 1 phổ rộng hơn, trong đó có cả tác dụng gây độc tế bào ung thƣ, tăng các phần tử MHC lớp 1 cho tế bào Tc hoạt động, nhằm tiêu diệt các tế bào ung thƣ. Khi dùng Crila để điều trị cho chuột chiếu tia thì các tế bào đều có xu hƣớng gây tăng chế tiết, đƣa về trị số sinh học hay cao hơn của hai cytokin nghiên cứu là IL-2 và TNFα.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2012 đến tháng 12/2012.
Các mẫu máu bệnh nhân đƣợc thu thập tại Bệnh viện K Hà Nội.
Các kỹ thuật nuôi cấy tế bào, thu dịch nổi, chiết tách ARN và phân tích
đƣợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm của Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh, Trƣờng Đại học Y Hà nội.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
2.2.1. Bệnh nhân
10 ml máu đƣợc lấy từ bệnh nhân UTVMH giai đoạn trƣớc điều trị tia xạ, hóa chất nằm tại khoa xạ 1 và xạ 3, Bệnh viện K Hà Nội từ tháng 3/2012, tuổi từ 12 đến 78 tuổi.
2.2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân * Tiêu chuẩn lâm sàng
Bệnh nhân mới, đƣợc chẩn đoán xác định là UTVMH dựa vào kết quả giải phẫu bệnh của mô sinh thiết lấy từ khối u vòm họng. Các bệnh nhân đƣợc chọn vào
nghiên cứu này đƣợc xếp loại giai đoạn từ III đến IVB với T1-4N0-3M0 theo cách
phân loại T.N.M và giai đoạn lâm sàng của Liên ban phân loại ung thƣ đầu, cổ Hoa Kỳ (American Joint Committee on Canner – AJCC) năm 1997 cụ thể.
Giai đoạn II: gồm T1-2N0-1M0
Giai đoạn III: gồm T1-2N2 hoặc T3N0-2M0
Giai đoạn IVA: T4N0-2M0
* Tiêu chuẩn xét nghiệm
Thể mô bệnh học đƣợc lựa chọn là thể ung thƣ biểu mô không biệt hóa (UCNT) dựa trên kết quả của phòng xét nghiệm giải phẫu bệnh, bệnh viện K Hà Nội.
2.2.1.2. Các đối tượng không đưa vào nghiên cứu
Các thể mô bệnh học khác ngoài ung thƣ biểu mô không biệt hóa.
Các bệnh nhân ở giai đoạn I, II và có di căn (M1) trƣớc khi đƣợc điều trị
tia xạ lần đầu (quá muộn nên bệnh nhân thƣờng xin về nhà).
Các bệnh nhân tái phát hoặc đến khám định kỳ
2.2.2. Người bình thường
10 ml máu đƣợc lấy từ ngƣời khỏe mạnh về lâm sàng, tuổi từ 20 đến 60 là cán bộ, sinh viên trƣờng Đại học Y Hà Nội.
2.2.3. Vật liệu nghiên cứu
Thuốc viên nén Crilin T hàm lƣợng 250 mg/viên, đƣợc cung cấp bởi
Nguyễn Thị Ngọc Trâm, Công ty Thiên dƣợc, Bình Dƣơng, Việt nam.
ARN của tế bào dòng chuẩn CTLL-2 và L929 làm chứng cho mARN của
IL-2 và TNFα trong kỹ thuật RT-PCR đƣợc cung cấp bởi phòng thí nghiệm của Khoa Vi sinh, Sinh học tế bào và Khối u, Viện Karolinska, Stockhkolm, Thụy điển.
Môi trƣờng và dung dịch sử dụng
- Môi trƣờng RPMI 1640, dạng lỏng có màu cam, trong, pH 7.4, bảo
quản 12 tháng kể từ ngày sản xuất. Môi trƣờng RPMI dạng bột có thể sử dụng trong vòng 36 tháng kể từ ngày sản xuất. Cả hai dạng này đều
bảo quản ở tủ mát 4 - 80
Dung dịch sử dụng
- Dung dịch PBS (Phosphat Butffer Saline)
Bảng 2.1. Thành phần dung dịch PBS Thành phần Hàm lƣợng NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g Nƣớc cất vừa đủ 1000 ml o Chuẩn pH đến 7.4 o Hấp vô trùng dung dịch ở 1210C
o Bảo quản trong tủ mát 40C
- Dung dịch FBS (Fetal Bovine Serum)
o Dung dịch đƣợc sản xuất bởi GIBCOTM tại Mexico đạt tiêu
chuẩn nhập khẩu của USDA.
o Dung dịch FBS đã qua các thử nghiệm kiểm tra tính chất, đảm
bảo không có sự hiện diện của mycoplasma, virus và nội độc tố.
o Bảo quản ở tủ lạnh 4oC
- Dung dịch tách lympho: Ficol 1.070 (GE heathcare, Bjorgatan 30 751
84 Uppsala, Sweden)
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Nuôi cấy tế bào lympho
10 ml máu chống đông EDTA của ngƣời thƣờng hoặc bệnh nhân ung thƣ vòm họng giai đoạn III, IV chƣa điều trị đƣợc nuôi cấy theo quy trình sau:
- Chuyển máu đã pha loãng sang ống nghiệm nhựa Falcon 50 ml
- Cho 10 ml ficoll xuống đáy ống nghiệm
- Ly tâm 3000 vòng/phút x 20 phút, ly tâm lạnh (nhiệt độ 40C)
- Hút lấy vòng bạch cầu lympho chuyển sang ống nghiệm mới 10 ml
- Rửa tế bào lympho bằng RPMI hoặc dung dịch PBS, ly tâm 1200
vòng/phút trong 10 phút, tiến hành rửa 2 lần
- Tái hòa tan tế bào trong môi trƣờng RPMI (bổ sung đủ 1000ml)
- Đếm tế bào: 1 giọt tế bào + 1 giọt xanh trypan để phân biệt sống chết.
- Nhỏ 1 x 106 tế bào vào các giếng của phiến nhựa, mỗi mẫu bao gồm 8
giếng (4 giếng IL-2, 4 giếng TNFα)
- Nhỏ thuốc vào các giếng: chứng âm, chứng dƣơng (levamisole), Critin T
liều thấp (nồng độ 0,25mg/ml), Critin T liều cao (0,5mg/ml).
- Đặt phiến nhựa vào tủ ấm có 5% CO2, theo dõi thu hoạch tế bào ở các
thời điểm thí nghiệm: thu hoạch giếng để phân tích TNFα trong 4 giờ, thu hoạch giếng để phân tích IL-2 trong 8 giờ.
- Hút RPMI có tế bào và cho vào các ống nghiệm nhựa 5ml
- Ly tâm 2000 vòng/phút x 5 phút
- Chuyển dịch nổi sang ống nghiệm mới (5ml) bảo quản - 200C
- Rửa cặn tế bào bằng ly tâm 2000 vòng/phút x 5 phút trong PBS
- Cặn tế bào đƣợc bảo quản trong tủ -20oC đến khi tách ARN.
2.3.2. Đếm số lượng bạch cầu và dòng bạch cầu lympho
Số lƣợng bạch cầu và các dòng tế bào bạch cầu lympho đƣợc tiến hành trên máy phân tích huyết học tự động KX - 21 của hãng Sysmex (Nhật Bản).
Nguyên lý: Đếm tế bào trên dòng chảy theo kích thƣớc tế bào.
Tiến hành: Máu toàn phần đƣợc chống đông bằng EDTA, sau đó dựa vào máy phân tích tự động, sau một phút cho kết quả nhiều thông số trong đó có số lƣợng bạch cầu và số lƣợng dòng bạch cầu lympho (lấy máu xong làm ngay trong 6 giờ đầu).
Kỹ thuật chiết tách ARN đƣợc sử dụng theo hóa chất Trizol (Invitrogen Life Techonologies, Hoa kỳ), theo quy trình hƣớng dẫn bởi công ty gồm các bƣớc nhƣ sau:
Phá vỡ tế bào
Cho 1ml dung dịch Trizol vào ống Eppendorf 1,5 ml có chứa cặn tế bào lympho, trộn đều bằng pipette và ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Tách lớp có chứa ARN
- Cho 0,2 ml choloroform, lắc đều trong 15 giây. Để hỗn hợp thu đƣợc ở
nhiệt độ phòng trong 10 phút.
- Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút ở 40C.
- Hút lớp không màu ở trên cùng sang một ống eppendorf sạch để tủa ARN.
Kết tủa ARN
- Cho isopropanol vào ống eppendof chứa ARN theo tỷ lệ thể tích (1:1),
trộn đều và để hỗn hợp trong 10 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm 15000 vòng/phút x 15 phút ở 40C, thu kết tủa ARN.
Rửa ARN
- Cho 1 ml ethanol 70%, vortex để trộn đều cặn ARN.
- Ly tâm 7000 vòng/phút x 5 phút ở 4oC, thu kết tủa ARN và để vừa khô
trong tủ hút thông khí.
Hòa tan ARN.
- Cho 50 µl H2O khử ion không có RNase
- Trộn đều và để trong 10-15 phút ở nhiệt độ phòng.
- Xác định nồng độ ARN dựa trên giá trị OD260 vàchất lƣợng dựa vào tỷ lệ OD260/280.
- Điện di ARN thu đƣợc để kiểm tra chất lƣợng về kích thƣớc, độ đứt gãy
của ARN tổng số.
Bảo quản ARN ở -800
C.
2.3.4. Tổng hợp cADN
cADN đƣợc tổng hợp từ khuôn mẫu ARN theo quy trình của kit tổng hợp
cADN SuperScriptTM First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen). Các
bƣớc nhƣ sau:
- Tổng thể tích 10 µl (0,3 µg ARN tổng số, 1 µl dNTPS 10 mM, 1 µl mồi
ngẫu nhiên 0,5 µg/µl và H2O). Hỗn hợp đƣợc ủ ở 650
C trong 5 phút và làm lạnh trong đá trong ít nhất 1 phút.
- Bổ sung 9 µl thể tích hỗn hợp (2 µl 10X RT buffer, 4 µl MgCl2 25 mM, 2
µl DTT 0,1 M và 1 µl ARNseOUTTM 40 U/µl) vào hỗn hợp trên và ủ
phản ứng ở 420
C trong 2 phút.
- Bổ sung 1 µl SuperScriptTM
III RT 50U/µl vào hỗn hợp và tiếp tục phản ứng ở 42°C trong 60 phút.
- Dừng phản ứng ở 70°C trong 15 phút và làm lạnh nhanh ở nƣớc đá đang tan.
2.3.5. Kỹ thuật RT-PCR
Thiết kế mồi
Mồi là một chuỗi các nucleotide tổng hợp (oligonucleotid) có độ dài từ 18-30 nucleotid, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự 2 đầu mạch khuôn mẫu. Mỗi cặp mồi gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc, các mồi này phải không đƣợc tự bổ sung cho nhau, không hình thành cấu trúc kẹp tóc và đảm bảo đủ dài để bắt cặp chính xác và