Phản ứng PCR đang đƣợc sử dụng rộng rãi ở rất nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu hay chẩn đoán trên thế giới. Phản ứng này cho phép khuếch đại một đoạn gen đặc hiệu với các mồi có trình tự mồi đặc hiệu cho gen đó và hỗn hợp các
ADN khuôn mẫu, sử dụng các chu kỳ nhiệt khác nhau, đƣợc đăng tải bởi nhiều công trình nghiên cứu [44]. RT-PCR cũng là một trong các loại của PCR, cho phép xác định sử biểu lộ của gen ở mức độ ARN cũng sẽ tuân theo nhƣng quy luật trên. Tuy nhiên trƣớc hết cần phải chuyển từ mARN sang cDNA bằng một phản ứng với enzym sao chép ngƣợc.
Trình tự cặp mồi B2M đƣợc lấy từ công trình của Nguyễn Văn Đô và cs (2012) [42]. Còn 02 cặp mồi IL-2 và TNFα do chúng tôi tự thiết kế dựa vào phần mềm Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/). Kích thƣớc của các cặp mồi nằm trong khoảng 65-140bp, là những kích thƣớc ngắn có thể dùng cho cả ARN đƣợc chiết tách từ tế bào tƣơi, nhƣng cũng có thể dùng cho ARN từ các lắt cắt tổ chức đã đúc paraffin. Theo kinh nghiệm của chúng tôi, khi sử dụng một cặp mồi mới cho phản ứng PCR, các nồng độ Mg++ khác nhau cần phải thử để tối ƣu hóa phản ứng. Tùy theo độ nhạy của mỗi cặp mồi mà phản ứng sẽ diễn ra theo các điều kiện khác nhau.
Các cặp mồi này đều đƣợc khuếch đại đơn mồi với các tế bào dòng CTLL-2 (IL- 2) và L929 (TNFα), chúng đều đƣợc thử điều kiện tối ƣu và cho kết quả dƣơng tính với 01 băng duy nhất cho mỗi gen nghiên cứu và gen nội chuẩn B2M (Hình 3.1 A, B, C).
Hình 3.1. RT-PCR đơn mồi xác định biểu lộ các gen B2M, IL-2 và TNFα ở các tế bào dòng chuẩn
Chú thích: Marker: 0.5µg ADN thang chuẩn dải thấp (low range DNA marker -Fermentas). A) Biểu lộ gen nội chuẩn B2M ở hai dòng tế bào L929 (mẫu 2) và CTLL-2 (mẫu 3). B) IL-2 biểu lộ ở dòng tế bào (CTLL-2). C) TNFα biểu lộ ở dòng tế bào (L929).