Đó là phương pháp phát hiện kháng thể kháng virút cúm trong huyết thanh bệnh nhân. Có 3 phương pháp cơ bản được sử dụng là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI), thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) và phản ứng trung hoà vi lượng (MN). Kết quả được xác định dựa vào việc phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu virút cúm (ELISA, MN) hoặc sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh (HI). Chẩn đoán huyết thanh học chỉ có ý nghĩa hồi cứu và có tác dụng rất hạn chế đối với các trường hợp lâm sàng. Tuy nhiên, nó cũng là cơ sở cho việc chẩn đoán nếu như việc phát hiện kháng nguyên hoặc vật liệu di truyền của virút không đạt kết quả do chất lượng bệnh phẩm hoặc một lý do nào khác.
1.7.3.1. Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition test - HI)
Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) được Hirst GK phát hiện năm 1942 [56]. Nguyên lý của phản ứng là kháng thể (KT) kháng HA đặc hiệu virút cúm (antiheamagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1, A/H3, A/H5, B…) có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầu. Hồng cầu chuột lang 0,75% hoặc hồng cầu gà 0,5% được sử dụng trong phản ứng HI để phát hiện KT kháng virút cúm mùa, hồng cầu ngựa 1% được sử dụng để phát hiện KT kháng virút cúm A/H5N1 [21, 22].
Phản ứng HI tương đối đơn giản, kinh tế, có thể áp dụng để phát hiện sự lưu hành của KT kháng đặc hiệu virut cúm với một số lượng mẫu lớn. Phần lớn kháng thể kháng HA đều được phát hiện bằng phản ứng HI, vì vậy đây là phản ứng đặc hiệu phân týp đối với chẩn đoán huyết thanh học cúm. Tuy nhiên, phản ứng HI chỉ có giá trị trong chẩn đoán cúm khi có mẫu huyết thanh kép để xác định được sự biến động kháng thể (tăng gấp 4 lần) giữa 2 mẫu huyết thanh. Mẫu huyết thanh đơn không có giá trị trong chẩn đoán. Mặt khác, theo những nghiên cứu gần đây cho thấy phản ứng HI có độ nhạy thấp hơn so với phản ứng trung hòa vi lượng [123].
1.7.3.2. Phản ứng trung hoà vi lượng (Microneutralization test - MN).
Phản ứng trung hòa vi lượng – ELISA được Hormon và cs phát triển năm 1988 [47]. Nguyên lý của phản ứng là sử dụng kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu nucleoprotein (NP) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên NP trong tế bào nhiễm virút cúm. Sử dụng phương pháp Reed & Muench để tính giá trị liều gây nhiễm 50% trên tế bào (TCID50) [96].
Phản ứng trung hòa vi lượng là một phản ứng nhạy và đặc hiệu, có khả năng phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu virút cúm A/H5N1 và kháng thể kháng các phân týp virút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI không có khả năng phát hiện được [123]. Phản ứng này dễ tiến hành vì không cần kháng nguyên tinh khiết. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là thí nghiệm phức tạp, thời gian tiến hành thí nghiệm kéo dài ( 2 ngày) và phải làm việc trực tiếp với virút sống, đặc biệt là virút cúm A/H5N1, nên thí nghiệm phải tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3.
1.7.3.3. Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (Enzyme linked – immusorbent assay - ELISA)
Thử nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme (ELISA) được Murphy và cs phát triển năm 1980 để đánh giá đáp ứng kháng thể của những người tình nguyện tiêm vắc xin cúm A [77]. Đây là thử nghiệm được sử dụng để phát hiện kháng thể IgG và IgM kháng virút cúm. Kháng thể có trong huyết thanh bệnh nhân sau khi gắn với kháng nguyên đã gắn trên giá rắn sẽ được phát hiện bằng kháng thể khác. Ở phương pháp trực tiếp, kháng thể phát hiện được cộng hợp trực tiếp với enzyme. Còn trong phương pháp gián tiếp, kháng thể không được đánh dấu mà được phát hiện bằng kháng thể kháng IgG và IgM đặc hiệu loài cộng hợp với enzyme.
Thử nghiệm ELISA được sử dụng rộng rãi để phát hiện kháng thể IgG và IgM kháng virút cúm [73, 77, 123]. Kháng nguyên sử dụng cho thử nghiệm này đã được xử lý, bất hoạt nên đảm bảo độ an toàn sinh học cao.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Định nghĩa ca bệnh
* Bệnh nhân hội chứng cúm
- Sốt cao trên 38oC.
- Đau đầu, đau mỏi người, ho khan, có thể kèm theo viêm long đường hô hấp.
* Bệnh nhân viêm phổi nặng nghi nhiễm virút cúm A/H5N1
- Sốt cao trên 380C.
- Biểu hiện hô hấp: chảy nước mũi, ho, khò khè, khó thở.
- XQ phổi có tổn thương.
- Bạch cầu dưới 5000/mm3
- Có yếu tố dịch tễ liên quan (tiếp xúc với gia cầm ốm, ăn thịt gia cầm ốm…).
2.1.2. Cỡ mẫu, thời gian và địa điểm
2.1.2.1. Bệnh nhân hội chứng cúm
Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân hội chứng cúm được thu thập trong 8 năm (2001- 2008) tại Hà Nội và các tỉnh Miền Bắc Việt Nam: 15.403 bệnh nhân (bảng 2.1). Trong đó:
+ Năm 2001 – 2005: thu thập ở 4 điểm tại Hà Nội bao gồm: Bệnh viện Nhi Trung Ương, Bệnh viện Bạch Mai, phòng khám Nhi quận Thanh Xuân và Hai Bà Trưng.
+ Năm 2006-2008: thu thập ở 7 điểm giám sát tại Miền Bắc bao gồm: Viện Các bệnh truyền nhiễm và nhiệt đới Quốc gia, Viện Nhi Trung Ương, phòng khám đa khoa Thanh Xuân, phòng khám Đa khoa Bà Triệu, TTYT huyện Kiến Xương- Thái Bình, TTYT thị xã Hòa Bình và TTYT huyện Cao Lộc- Lạng Sơn.
Bảng 2.1. Số bệnh nhân hội chứng cúm tại Miền Bắc Việt Nam, 2001-2008
2.1.2.2. Bệnh nhân viêm phổi nặng nghi nhiễm virút cúm A/H5N1
Mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân viêm phổi nặng nghi nhiễm virút cúm A/H5N1 thu thập trong 6 năm (6/2003-5/2009) tại 23 tỉnh/thành phố Miền Bắc Việt Nam: 1.739 bệnh nhân (bảng 2.2).
Bảng 2.2. Số bệnh nhân viêm phổi nặng nghi nhiễm virút cúm A/H5N1 tại Miền Bắc Việt Nam, 6/2003-5/2009
Năm Bệnh nhân 2001 2182 2002 1462 2003 1064 2004 1091 2005 1264 2006 2340 2007 3046 2008 2954 Tổng số 15 403 Năm Bệnh nhân 2003 16 2004 283 2005 682 2006 138 2007 254 2008 215 2009 151 Tổng số 1739
Hình 2.1. Hệ thống giám sát trọng điểm Cúm tại 4 miền: Bắc, Trung, Nam và Tây Nguyên
Miền Bắc : 7 điểm giám sát
Miền Trung : 3 điểm giám sát
Miền Nam : 4 điểm giám sát
2. 2. VẬT LIỆU
2.2.1. Mẫu bệnh phẩm
Mẫu bệnh phẩm được lấy ở những bệnh nhân hội chứng cúm hoặc viêm phổi nặng nghi nhiễm virút cúm từ 1-5 ngày kể từ khi khởi bệnh, bảo quản 2-80C trong khi vận chuyển tới phòng thí nghiệm và cất giữ -800C cho đến khi sử dụng.
Bệnh phẩm để xác định virút : Dịch ngoáy họng, dịch mũi, dịch nội khí quản, dịch phế nang được bảo quản trong môi trường vận chuyển virút.
Dịch ngoáy họng: Đưa tăm bông vào vùng hầu họng, miết mạnh và quay tròn tăm bông tại khu vực 2 amidan và thành sau họng và rút ra theo chuyển động xoay tròn. Đưa ngay tăm bông vào ống nhựa đã có sẵn 2-3ml môi trường bảo quản virút.
Dịch mũi: Đưa tăm bông dọc theo sàn tới khoang mũi hầu, để ở đó vài giây và rút ra theo chuyển động xoay tròn. Đưa ngay tăm bông vào ống nhựa đã có sẵn 2-3ml môi trường bảo quản virút.
Dịch nội khí quản:Bệnh nhân khi đang thở máy, đã được đặt nội khí quản.Dùng 1 ống hút dịch, đặt theo đường nội khí quản và dùng bơm tiêm hút dịch nội khí quản theo đường ống ta đã đặt.Cho dịch nội khí quản vào ống nhựa đã có sẵn 2-3ml môi trường bảo quản virút.
Tuỳ từng loại căn nguyên để thu thập bệnh phẩm thích hợp :
Virút cúm mùa : dịch ngoáy họng hoặc dịch mũi
Virút cúm A/H5N1: dịch ngoáy họng, dịch nội khí quản.
2.2.2. Tế bào
- Tế bào thường trực thận chó (Mardin- Darby Canine Kidney cells): MDCK (CDC - Mỹ).
2.2.3. Sinh phẩm
Bảng 2.3 Hệ thống mồi sử dụng để phát hiện vật liệu di truyền virút cúm bằng phƣơng pháp RT-PCR
STT Virút Tên mồi Nguồn gốc Vị trí trong
bộ gen Sản phẩm khuếch đại (bp) 1 Cúm A (Influenza A) M2-For3/M2- Rev Niigata- Nhật Bản M2 232 Flu A F/R CDC – Mỹ M2 120 M30F/ M264 R2 NIID – Nhật Bản M2 244 2 Cúm B (Influenza B) 96B/96BR Niigata- Nhật Bản HA 197 Flu B F/R CDC-Mỹ HA 120 3 Cúm A/H1 H1 HA F/R CDC-Mỹ HA 120 4 Cúm A/H3 H3 HA F/R CDC-Mỹ HA 120 5 Cúm A/H5 H5-1/ H5-3 WHO HA 219 H5HA F/ R CDC-Mỹ HA 120 6 Cúm A/ N1 N1 NIID – Nhật Bản NA 339 7 Cúm A/ N2 N2 NIID – Nhật Bản NA 615
- Bộ sinh phẩm tách chiết ARN: QIAamp viral RNA Mini Kit, 250 preps, Cat No 52904, Qiagen.
- Bộ sinh phẩm dụng cho phương pháp RT - PCR: QIAGEN Onestep RT- PCR kit, Cat. No 210212.
2.2.3.2. Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp Realtime RT-PCR
Bảng 2.4. Hệ thống mồi và probe sử phát hiện virút cúm A/H5N1 bằng phƣơng pháp Realtime RT-PCR
Mồi và probe Trình tự 5’-3’ Nồng độ
Flu A xuôi CAT GGA RTG GCT AAA GAC AAG ACC 40uM
Flu A ngược AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA 40uM Flu A probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG 10uM
H5 HA xuôi TGG AAA GTG TAA RAA ACG GAA CGT 40uM
H5 HA ngược TGA TTG CCA GYG CTA GGG AAC T 40uM H5 HA probe TGA CTA CCC GCA G''T''A TTC AGA AGA
AGC AAG ACT AA
10uM
RNP xuôi AGA TTT GGA CCT GAG AGC G 40uM
RNP ngược GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 40uM
RNP probe TTC TGA CCT GAA GGC TCT GCG CG 10uM
- SuperScrip III Platium One-Step Quantitative RT-PCR System (Invitrogen) Cat No. 11732-088.
2.2.3.3. Sinh phẩm sử dụng cho phương pháp xác định trình tự gen
- Uni 12 primer (CDC - Mỹ)
- PCR Qiagen proof start kit (Cat no 202203).
- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm PCR: Purification kit Qiaquick 250, Cat. No. 28106, Qiagen.
- Bộ sinh phẩm cho chu kỳ nhiệt tạo đoạn ADN gắn các dideoxynucleotide (Cycle sequencing): BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit P/N: 4336917, ABI
- Bộ sinh phẩm tinh sạch sản phẩm đã gắn các dideoxynucleotide: DyeEx 2.0 Spin kit, Cat. No. 63206, Qiagen.
- HiDi Formamide ABI 25ml P/N: 4311320, ABI.
- Hệ thống mồi:
+ Gen HA của virút cúm A/H5N1 (Tokyo, Nhật bản)
+ Gen NA của virút cúm A/H5N1 (Tokyo, Nhật bản)
2.2.3.4. Sinh phẩm sử dụng cho định týp virút cúm
- Bô sinh phẩm kháng huyết thanh chuẩn dùng cho phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) để định týp virút cúm được TCYTTG cung cấp hàng năm.
2.2.4. Các chủng virút mẫu chứng
* Mẫu chứng dương sử dụng cho phương pháp RT-PCR, Realtime RT-PCR
được cung cấp bởi Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện VSDTTƯ; CDC-Mỹ, Niigata, NIID-Nhật Bản.
2.2.5. Trang thiết bị và dụng cụ
2.2.5.1. Trang thiết bị
Tên mồi Trình tự ( 5’ - 3’) Sản phẩm
khuếch đại (bp)
H5-#3F CTC GGA AAC CCA ATG TGT GAC
1366
H5-R1 GAC AGT ATT TGG TAA ATT CC
Tên mồi Trình tự ( 5’ - 3’) Sản phẩm
khuếch đại (bp)
Yamagata NAU12+14F1
CTC GGA AAC CCA ATG TGT GAC
1137 HK213NA
Trang thiết bị Hãng
Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3
Buồng cấy an toàn sinh học (Biosafety Cabinet)- Class 2 Tủ ấm CO2
Kính hiển vi quang học lộn ngược Tủ lạnh: 40C, -200C và -800C Máy ly tâm
Máy khuếch đại gen Máy real-time PCR Máy giải trình tự gen Máy đọc ELISA Vortex Viện VSDTTƯ Bioquell - Anh Jouan - Pháp Ceti - Bỉ Sanyo- Nhật Rotofex - Mỹ MJ-Mỹ Biorad ABI 3100-Avant Biorad IKA – Malaysia 2.2.5.2. Dụng cụ * Dụng cụ lấy bệnh phẩm: Que ngoáy họng và tỵ hầu.
Ống chứa môi trường vận chuyển virút.
* Trang bị phòng hộ cá nhân: quần áo chống dịch mặc một lần, khẩu trang N95…
* Dụng cụ thí nghiệm
Chai nhựa nuôi cấy tế bào 25cm2
, 75cm2
Phiến nhựa vi lượng 96 giếng đáy chữ U hoặc V dùng cho phản ứng HI. Pipet tự động vi lượng các loại: 0,5 l – 1000 l
Đầu côn vô trùng các loại, có phin lọc: 0,5 l – 1000 l. Ống eppendof: 0,2ml – 1,5ml.
Và các dụng cụ cần thiết khác.
2.3. PHƢƠNG PHÁP 2.3.1. Phân lập virút
2.3.1.1. Chuẩn bị môi trường
Thành phần Thể tích (ml) Nồng độ cuối cùng
D-MEM x10
Fetal Bovine Serum (FBS) 7,5% Penicillin/Streptomycin NaHCO3 Nước cất vô trùng 50 50 5 4 391 10% 100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin Tổng số 500
* Môi trường nuôi cấy virút (D-MEM 2% BSA, Trypsin treated- TPCK)
Thành phần Thể tích (ml) Nồng độ cuối cùng
D-MEM x10
Bovine serum albumine 7,5% Penicillin/Streptomycin Trypsin treated- TPCK* Nước cất vô trùng 50 10 5 0,5 434,5 2% 100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin 2 µg/ml Tổng số 500
* Chuẩn bị Trypsin treated- TPCK
(1) Hòa tan 20 mg TPCK-trypsin* vào 10 ml H2O cất vô trùng. (2) Dùng màng lọc 0.2 µm để lọc vô trùng.
(3) Chia nhỏ và cất giữ ở -20o
C.
* Chuẩn bị kháng sinh để xử lý bệnh phẩm
(1) Kanamycin sulfate: Hòa tan 1ml kanamycin sulfate (5000ug/ml) vào 19 ml H20 CM= 250ug/ml
(2) Cipro-HCl: Hòa tan 1g cipro-HCl vào 100ml H2O CM= 10mg/ml (3) Trộn (1) với (2) theo tỷ lệ 1:1 Dung dịch kháng sinh sử dụng.
2.3.1.2. Các bước tiến hành
* Yêu cầu về an toàn sinh học
Đối virút cúm mùa (cúm A/H3N2, A/H1N1, B...): việc phân lập virút phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2.
Đối với virút cúm gia cầm (cúm A/H5N1, H9N2...): là virút nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virút phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3.
* Xử lý mẫu bệnh phẩm lâm sàng
1.Trộn đều mẫu bệnh phẩm bằng máy vortex. Loại bỏ tăm bông ngoáy họng. 2. Thêm 20 µl kháng sinh xử lý bệnh phẩm ( 2.3.1.1).
3. Để tại nhiệt độ phòng 30-45 phút. 4. Sử dụng mẫu để phân lập.
* Phân lập trên tế bào MDCK
1. Chọn chai tế bào MDCK 25 cm3 mọc đẹp 1 lớp.
2. Loại bỏ môi trường phát triển, rửa tế bào 2 lần bằng PBS (-) và 1 lần bằng môi trường D-MEM chứa 2 µg/ml TPCKtrypsin.
3. Gây nhiễm 500 µl bệnh phẩm, ủ 37o
C/60 phút
4. Thêm môi trường nuôi cấy virút BSA 2%, Trypsin. Ủ 370C/ 7 ngày. 5. Theo dõi sự hủy hoại tế bào (CPE) hàng ngày.
- Nếu có CPE, khẳng định lại bằng kỹ thuật RT-PCR và xác định hiệu giá HA bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà hoặc chuột lang.
- Thu hoạch virút, bảo quản tại -700C.
* Khuếch đại và lựa chọn chủng virút
1. Các chủng virút thu hoạch được tiến hành khuếch đại trên chai tế bào MDCK 75 cm3 mọc đẹp 1 lớp.
2. Lựa chọn các chai tế bào xuất hiện CPE từ 72 đến 96 giờ sau khi gây nhiễm.
3. Kiểm tra hiệu giá bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà hoặc ngựa (HA). 4. Thu hoạch và cất giữ tại -700C các chủng virút có hiệu giá HA ≥ 16.
2.3.2. Định týp virút bằng phản ứng ngăn ngƣng kết hồng cầu (HI)
Phản ứng HI được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 2 vì dùng kháng nguyên bất hoạt. Phản ứng được tiến hành theo thường quy của Viện VSDTTƯ.
2.3.2.1. Chuẩn bị hồng cầu
- Định týp virút cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1 và B): sử dụng hồng cầu gà 0,5 % hoặc hồng cầu chuột lang 0,75% trong đệm PBS, pH: 7,2.
2.3.2.2. Xử lý kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera)
Để loại bỏ những chất ức chế không đặc biệt trong kháng huyết thanh (HT) chuẩn:
- 1 thể tích kháng HT kết hợp với 3 thể tích dung dịch RDE (enzyme phá huỷ các thụ thể – Recepter Destroying Enzyme). Ủ 370C qua đêm.
- Bất hoạt ở 560
C trong vòng 30 phút.
- Bổ sung 6 thể tích nước muối sinh lý NaCl 0,85%. Như vậy, kháng HT chuẩn đã được pha loãng 1/10.
2.3.2.3. Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA)
Phương pháp này được tiến hành trên phiến nhựa 96 giếng đáy tròn ( hồng