* Tính cảm nhiễm
Mọi cá thể đều có thể nhiễm cúm và mắc bệnh cúm. Ở người lớn, khi bị nhiễm virút cúm có thể có biểu hiện lâm sàng từ nhiễm trùng không triệu chứng tới
viêm phổi do virút tiên phát tiến triển nhanh dẫn tới tử vong. Ở trẻ nhỏ, nhiễm virút cúm thường sốt cao có thể kèm theo co giật.
Đối tượng có nguy cơ mắc cúm cao: người già trên 65 tuổi, trẻ em, phụ nữ có thai, người mắc bệnh mãn tính …
* Đáp ứng miễn dịch
Đáp ứng miễn dịch của cơ thể với nhiễm virút được nhận biết thông qua kháng thể. Trong quá trình bị nhiễm virút cúm, kháng thể kháng glycoprotein HA và NA đóng vai trò rất quan trọng. Kháng thể kháng hemagglutinin (HA) ngăn cản virút xâm nhập vào tế bào chủ, kháng thể kháng neuraminidase (NA) ngăn cản sự giải phóng của virút ra khỏi tế bào chủ [26, 87]. Francis là người đầu tiên phát hiện ra kháng thể trung hoà đối với virút cúm ở dịch mũi [64].
Trong nhiễm trùng tiên phát, các kháng thể đặc hiệu với hemagglutinin IgA, IgM và IgG xuất hiện ở dịch mũi, trong đó chủ yếu là kháng thể IgA và IgM [78]. Kháng thể IgA có vai trò quan trọng trong ngăn chặn sự nhiễm virút, hoạt động của nó diễn ra tại bề mặt màng nhày của bộ máy hô hấp.
Trong nhiễm virút thứ phát, kháng thể IgG hạn chế sự nhân lên của virút và interferon cũng giúp cho sự hồi phục có hiệu quả [78]. Những ức chế không đặc hiệu tới virút cúm cũng được biết tới, đó không phải là kháng thể và vai trò của nó trong việc ngăn chặn sự nhiễm bệnh cũng như hồi phục chưa rõ ràng.
Ngoài ra còn có vai trò của đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào thông qua tế bào lympho T và các thực bào tại các phế nang cũng đóng vai trò trong quá trình hồi phục của bệnh.
1.6. BIỆN PHÁP DỰ PHÒNG VÀ KIỂM SOÁT BỆNH CÚM
1.6.1. Thuốc kháng virút
Hiện nay, có 2 nhóm thuốc được sử dụng để dự phòng và điều trị cúm. Đó là: - Amantadine và Rimantadine (Flumadine).
- Oseltamivir (Tamiflu) và Zanamivir (Relenza).
cách ức chế hoạt động của kênh ion M2, do đó ngăn cản sự “cởi áo” của virút [102, 120]. Amantadine được sử dụng để điều trị bệnh nhân nhiễm cúm A, không có tác dụng với virút cúm B hoặc C, là thuốc kháng virút cúm thế hệ đầu tiên.
Amantadine được sử dụng rộng rãi ở Nhật Bản, Anh…trong khi đó rimantadine đang được lưu hành rộng rãi tại Nga và các nước Châu Âu. Vai trò của amantadine rất khó đánh giá vì trong giai đoạn nhiễm virút cấp tính, thời gian nhân lên của virút ngắn. Tuy nhiên, một vài thử nghiệm đã chỉ ra rằng cả 2 loại thuốc này nếu sử dụng ở ngày đầu tiên của bệnh thì sẽ rút ngắn được thời gian trung bình của giai đoạn sốt. Nó được đánh giá là có hiệu quả hơn khi sử dụng thuốc này cho những bệnh nhân bị bệnh tim mạch hoặc bệnh viêm đường hô hấp mạn tính khi có nguy cơ nhiễm virút cúm.
Tuy nhiên, sự kháng thuốc cũng như những phản ứng phụ sau khi dùng thuốc kháng virút là vấn đề đáng quan tâm. Theo Hayden & Hay, Saito và cs cho thấy gần 1/3 số bệnh nhân đã xuất hiện sự kháng thuốc amantadine và rimantadine sau khi điều trị [52, 104]. Trong khi đó, tỷ lệ này là rất thấp đối những trường hợp chưa điều trị thuốc: 0-3% ở Nhật Bản, 1% ở Mỹ, Anh [118, 119, 125, 156]. Trong thời gian gần đây, tại Châu Á và Mỹ đã có sự tăng đáng kể các chủng virút cúm A/H3N2 kháng amantadine [17, 18, 97]. Đặc biệt, virút cúm H1N1/09 đại dịch trên thế giới cũng như tại Việt Nam hiện có tỷ lệ kháng thuốc cao (100%). Tuy nhiên, virút cúm A/H5N1 vẫn được đánh giá là nhạy cảm với các thuốc ở nhóm này [94].
* Oseltamivir (Tamiflu) và Zanamivir (Relenza): Ngăn cản sự giải phóng virút khỏi tế bào nhiễm nhờ ức chế hoạt động của enzyme neuraminidase (NA). Đây được coi là cơ chế hiệu quả nhất tác động vào virút. Phần lớn các virút không yêu cầu một cơ chế đặc biệt để giải phóng virút thế hệ mới ra khỏi tế bào nhiễm nhưng virút cúm thì quá trình giải phóng phải có sự tham gia trực tiếp của enzyme neuraminidase. Enzyme này tách axit sialic từ màng glycoprotein của virút, giải phóng virút. Nếu không có sự tham gia của enzyme này, virút sẽ bị giữ lại bên trong tế bào và không có cơ hội tấn công sang các tế bào khác.
nhờ sử dụng tia X. Cấu trúc của phức hợp neuraminidase và axit sialic được phát hiện đó là axit sialic chiếm giữ 2 trong 3 cấu tạo dạng “túi” trên neuraminidase. Oseltamivir và zanamivir được thiết kế dựa trên 2 cấu trúc đó để cạnh tranh vị trí bám vào HA của axit sialic ngăn cản sự xâm nhập của virút vào tế bào.
Hình 1.6. Cơ chế ức chế neuraminidase tại một số vị trí axit amin trên protein NA
*Nguồn: Collin và cs - Nature [90]
Sự kháng thuốc zanamivir chỉ tìm thấy ở một trường hợp trẻ em bị suy giảm miễn dịch [71]. Trong khi đó, những biểu hiện giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc tamiflu của virut cúm A cũng đã được xác nhận và có chiều hướng ngày càng tăng: 0,7% - 4% ở người lớn, 4% - 8% ở trẻ em và gần đây nhất thì tỉ lệ kháng tamiflu ở trẻ em sau khi điều trị thuốc đã tăng lên 18% [70, 72, 102]. Vì vậy, việc kiểm soát
phác đồ điều trị cũng như giám sát sự kháng thuốc của virút cúm là hết sức quan trọng.
Việc sử dụng thuốc kháng virút như oseltamivir hay amantadine đều có những hạn chế nhất định. Thực tế cho thấy một số lượng đáng kể các chủng cúm A/H5N1 lưu hành gần đây có hiện tượng kháng thuốc cũng như một số nghiên cứu tại Nhật Bản cho thấy những tác dụng phụ không mong muốn của thuốc. Vì vậy, cùng với việc sử dụng thuốc kháng virút thì biện pháp tốt nhất để phòng bệnh cúm A/H5N1 là tăng cường hệ thống giám sát, phát hiện, cách ly và điều trị ngay những trường hợp mắc đầu tiên đi cùng với các biện pháp xử lý gia cầm nhiễm bệnh.
1.6.2. Vắc xin cúm
1.6.2.1. Vắc xin cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1 và B)
Gây miễn dịch được coi là biện pháp hữu hiệu để phòng cả virút cúm A và B. Tuy nhiên, việc gây miễn dịch cũng đưa ra một số vấn đề đáng lưu tâm do virút cúm thay đổi liên tục và hiệu lực của vắc xin phụ thuộc vào sự phù hợp giữa chủng sản xuất vắc xin và chủng virút cúm đang lưu hành. Do đó, khối lượng vắc xin sản xuất hàng năm thường không đáp ứng đủ cho cộng đồng. Việc tiêm vắc xin được ưu tiên cho ba nhóm đối tượng:
+ Nhóm đối tượng có nguy cơ cao: người già, người tàn tật, người mắc bệnh mạn tính về tim, phổi, thận..
+ Nhóm tiếp xúc với các tác nhân gây nhiễm: nhân viên phòng thí nghiệm… + Nhóm người làm việc tại các dịch vụ công cộng: nhân viên y tế, cảnh sát…
Vắc xin cúm hiện tại có nhiều loại khác nhau
+ Vắc xin bất hoạt (inactivated vaccine) bao gồm các loại sau [48]
- Vaccine toàn bộ hạt virút bất hoạt: sử dụng formalin hoặc ß-
propiolactone.
- Vắc xin tiểu đơn vị hoặc kháng nguyên bề mặt HA và NA (subunit hoặc surface).
- Vắc xin thành phần tách rời của virut: toàn bộ hạt virút nhưng bị tách rời bằng ether (split).
+ Vắc xin sống giảm độc lực (Live attenuated influenza virus - LAIV): được sản xuất bằng hạt virút lai được tiến hành dựa trên việc sử dụng kháng nguyên HA, NA với các đột biến khác nhau. Sau đó, lựa chọn các hạt virút không có khả năng phát triển tại 37oC cấy truyền vào tế bào động vật hoặc phôi gà. Vắc xin được sử dụng bằng cách xông hơi qua đường mũi. Vắc xin này có hiệu lực kém hơn các loại vắc xin bất hoạt và chỉ dùng cho người khoẻ mạnh trong độ tuổi từ 5-49 [13, 83].
+ Vắc xin bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (reassortment vaccine):
tái tạo các virút từ các phân đoạn gen có lựa chọn khác nhau bằng kỹ thuật di truyền ngược (reverse genetic) [80, 81, 84].
Hiện tại, vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin bất hoạt đa giá, thành phần vắc xin bao gồm virút cúm A/H1N1, A/H3N2 và B.
1.6.2.2. Vắc xin cúm A/H5N1
Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều loại vắc xin cúm A/H5N1 cho người của các hãng Sanofi Pasteur – Pháp, Novartis - Thụy Sĩ, GlaxoSmithKline – Anh, Sinovac – Trung Quốc, Baxter – Mỹ… đã được cấp giấy phép lưu hành [24, 36, 37, 49, 127]. Tại Việt Nam, vắc xin cúm A/H5N1 đã sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm và đã được thử nghiệm lâm sàng [9]. Đây là vắc xin bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược: gen HA và NA thuộc virút cúm A/H5N1 ( clade 1 hoặc clade 2), trong đó, gen HA được loại bỏ 4 axit amin được cho rằng quyết định độc tính của virút tại khu vực phân tách HA1 và HA2. Các gen còn lại ( PA, PB1, PB2, M, NS và NP) là những gen của virút cúm A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1). Vắc xin cúm A/H5N1 sẽ là vắc xin đơn giá, chưa có nghiên cứu nào về khả năng phối hợp giữa vắc xin cúm gia cầm (A/H5N1) và vắc xin cúm mùa (A/H1N1, A/H3N2 và B).
1.7. CHẨN ĐOÁN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM
đoán cúm cơ bản trong phòng thí nghiệm thì ngày càng có nhiều các kỹ thuật chẩn
đoán mới, nhanh, hiện đại đáp ứng được nhu cầu xác định sớm sự nhiễm virút cúm để có các biện pháp cách ly, điều trị kịp thời tránh lây nhiễm cho người tiếp xúc
cũng như trong cộng đồng, hạn chế những thiệt hại về nhân lực cũng như về kinh tế do cúm gây ra. Việc phân tích các mẫu bệnh phẩm sinh học này sẽ là một khâu then chốt để hiểu được đặc điểm sinh học của tác nhân gây bệnh này, kể cả về những khía cạnh kháng thể sau khi lây nhiễm, quá trình khu trú và phát tán virút trong các dịch khác nhau của cơ thể.
1.7.1. Phương pháp phát hiện kháng nguyên
1.7.1.1. Thử nghiệm chẩn đoán nhanh (Quicktest)
Đây là một thử nghiệm miễn dịch phát hiện kháng nguyên của virút cúm, kháng thể đơn dòng có trong que thử kết hợp với kháng nguyên nucleoprotein (NP) của virút cúm.
Ưu điểm của thử nghiệm này là nhanh (cho kết quả trong vòng 15-20 phút), đơn giản, là một thử nghiệm khách quan có thể áp dụng cho bệnh phẩm lâm sàng hoặc hỗn dịch nuôi cấy virút. Tuy nhiên, nhược điểm của thử nghiệm này độ nhạy và độ đặc hiệu kém, một số bộ sinh phẩm không phân biệt được typ huyết thanh A hoặc B, không xác định được phân typ (H1, H3, H5...), giá thành cao (từ 12 USD – 25 USD/ 1 thử nghiệm). Theo tổng kết nghiên cứu của một số tác giả cho thấy độ nhạy trung bình 70 -75%, độ đặc hiệu trung bình 90- 99%; độ nhạy khi phát hiện virút cúm A cao hơn virút cúm B [21, 22].
Thử nghiệm này rất có hiệu quả trong sàng lọc và điều tra dịch cúm mùa ở người (cúm A/H1, H3, B...) nhưng không có giá trị trong việc phát hiện cúm A/H5N1 .
Hiện nay, trên thế giới có 10 bộ sinh phẩm chẩn đoán nhanh cúm trong đó 8 bộ do Mỹ và 2 bộ do Nhật Bản sản xuất bao gồm:
- Bộ sinh phẩm chỉ phát hiện cúm A: 1 bộ
- Bộ sinh phẩm phát hiện và phân biệt cúm A và B: 6 bộ
Directigen Flu A + B.
FLU OIA A/B.
XPECT FLU A/B.
NOW FLU A/B.
Capilia Flu A/B.
Influ A/B Quick.
- Bộ sinh phẩm phát hiện nhưng không phân biệt cúm A và B: 3 bộ
QuickVue Influenza Test.
FLU OIA.
ZstatFlu.
1.7.1.2. Phân lập và định týp virút
Yêu cầu về an toàn sinh học
Đối virút cúm mùa (cúm A/H3N2, A/H1N1, B...): việc phân lập virút phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2.
Đối với virút cúm gia cầm (cúm A/H5N1, H9N2...): là virút nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập virút phải được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3.
Phân lập virút được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm [22]. Chủng virút phân lập trong vụ dịch được nghiên cứu về các đặc điểm sinh học, sự biến đổi vật liệu di truyền và tính chất kháng nguyên để có thể dự báo được sự lan truyền của một chủng virút mới có độc lực cao trong giai đoạn tiếp theo và cho sự lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm.
Hiện nay, có 2 hệ thống phân lập được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dòng tế bào thường trực thận chó ( Mardin- Darby canine kidney cells - MDCK).
* Phân lập virút trên trứng: Virút cúm được phân lập đầu tiên trên trứng gà năm 1936. Sau khi cấy virút vào khoang niệu hoặc khoang ối, trứng được ủ ở 330
trong vòng 48h. Dịch niệu hoặc dịch ối thu được sau khi gặt trứng được kiểm tra hiệu giá bằng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu ngựa 1% [22]. Một số virút cúm A có thể phân lập trực tiếp bằng việc gây nhiễm vào khoang niệu nhưng cũng những chủng virút cúm A phải gây nhiễm trên dịch ối sau đó mới thích ứng lên khoang niệu trứng gà. Virút cúm A/H5N1 thường gây chết trứng sau 24h hoặc 48h gây nhiễm bệnh phẩm.
* Phân lập trên tế bào cảm thụ MDCK: Virút cúm có thể nhân lên trên các dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như MDCK, Vero. MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập virút cúm trên người. Khi phân lập virút trên các dòng tế bào thường trực phải bổ sung trypsin (TPCK) – protease ngoại sinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trypsin TPCK có ảnh hưởng tới sự phân tách phân tử HA thành HA1 và HA2, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập của virút vào tế bào cảm thụ. Tuy nhiên, đối với các dòng tế bào tiên phát thì protease là yếu tố nội sinh, vì vậy virút cúm vẫn có khả năng nhân lên mà không cần phải bổ sung trypsin trong quá trình nuôi cấy [88]. Ưu điểm của việc phân lập virút cúm trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, có khả năng phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm. Tuy nhiên, tuỳ theo mục đích nghiên cứu để lựa chọn phương pháp phân lập. Phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thế giới vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn virút với hiệu giá cao [43, 89]. Tuy nhiên, việc sản xuất vắc xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu [16, 63].
* Định týp virút: virút sau khi phân lập được định týp ( xác định đặc tính kháng nguyên ) bằng phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI).
1.7.1.3. Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang (Immunofluorescent assay - IFA)
Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật có hiệu quả trong chẩn đoán cúm. Tế bào cảm thụ sau khi gây nhiễm bệnh phẩm hoặc các tế bào biểu mô đường hô hấp trong bệnh phẩm lâm sàng (kháng nguyên) sẽ được rửa và cố định trên phiến kính. Kháng nguyên sau khi được cố định sẽ được gắn với các kháng thể đơn dòng
đặc hiệu týp và phân týp. Sau đó, kháng thể đơn dòng được phát hiện bằng kháng thể kháng IgG chuột gắn huỳnh quang FITC.
Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang là kỹ thuật nhanh và nhạy, được sử dụng thường xuyên trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh vật học. Nhưng kỹ thuật này đòi hỏi phải có chuyên gia trong việc thực hiện và đọc kết quả. Mặt khác, thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang đòi hỏi phải sử dụng tế bào đã được gây nhiễm virrút cúm hoặc trực tiếp từ bệnh phẩm lâm sàng, đặc biệt với virút cúm A/H5N1, nên các bước tiến hành thử nghiệm phải được tiến hành trong phòng thí